Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE

9.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/1474

⸱

12 октября 2009 г.

 , 
1Institute for Systems Biology

В этой статье

Краткое содержание

Описание процедуры количественного фосфорилирования использованием криодеструкция, мочевина solubilziation, HILIC фракционирования и IMAC обогащения фосфорилированных пептиды.

Аннотация

Этот протокол описывает роста и стимулирования, с жирной олеиновой кислоты, изотопно-тяжелой и легкой клетки С. CEREVISIAE. Клетки местности с помощью криодеструкции процедура в мясорубку шаровой мельнице и в результате grindate приведены в растворе мочевины солюбилизации. Эта процедура позволяет лизис клетки в метаболически неактивное состояние, сохраняя фосфорилирования и предотвращения переориентации phosphoproteome во время клеточного лизиса. После сокращения, алкилирования, трипсина переваривание белков, образцы обессоленной на C18 колонны и образец сложности сократились на фракционирования использованием гидрофильной хроматографии взаимодействия (HILIC). HILIC колонн преимущественно сохраняют гидрофильных молекул, которые хорошо подходят для phosphoproteomics. Фосфорилированных пептиды, как правило, элюируются позднее в хроматографического профиля, чем не фосфорилированных аналогов. После фракционирования, фосфопептиды обогащенного использованием иммобилизованных металла хроматографии, которая опирается на заряд основе сродство к фосфопептидов обогащения. В конце этой процедуры образцы готовы к количественному анализу методом масс-спектрометрии.

Протокол

Клеточного роста и средств массовой информации

  1. Единственная колония BY4742Δarg4Δlys1 клетки на ночь в 100 мл богатых СМИ OD 600 на 1,0, то семя на две 1 л культур минимальной среде дрожжи (0,17% Дрожжи азотистого основания, без сульфата аммония или аминокислот, 0,5% сульфат аммония), содержащий полный набор аминокислот, дополнен 20 мг / л изотопически нормального или тяжелого аргинин (13 C 6 15 N 4; Isotec) и лизина (13 C 6 15 N 2; Isotec).
  2. Клетки выращивались в течение 18 часов, чтобы OD 600 из 1,8. Очень важно, чтобы клетки пройти как минимум 9 поколений, чтобы добиться полного включения меченых изотопов. Свет образец осаждали, промывали стерильной водой, reseeded в олеат среде, содержащей (изотонически нормальной аргинин и лизин, 0,2% олеиновой кислоты (Sigma Chemicals) и 0,5% Твин 40 (Sigma Chemicals)) и стимулировали еще 85 минут. Это дает изотопно света, по отношению к аргинин и лизин, олеат-стимулированных образца и изотопно тяжелых глюкозы выращенных эталонного образца.

Лизиса клеток, выделения и фракционирования пептиды

  1. Взвесьте центрифуги бутылку. Урожай образцы центрифугированием в течение 3 минут. Удалить СМИ и аспирации лишнюю жидкость. Взвесьте гранул и бутылки (как правило доходности между 1-2 грамма), то вспышка заморозить в жидком азоте. Добавить объеме, эквивалентном гранулы вес "шлифовка" буфер для замороженных гранул в жидком азоте (фосфатно-солевым буфером (PBS, Gibco), 10% глицерина, Ингибиторы протеазы (SigmaFAST Таблетки ингибитор протеазы, Sigma) и HALT фосфатазы ингибиторы (Thermo Scientific )).
  2. Замораживание шлифовальные судна в жидком азоте. Подождите, пока жидкого азота перестает кипеть. Передача гранулы для шлифовальных судна, с замороженными шарикоподшипников.
  3. Grind при 600 оборотах в минуту с 1 мин 20 сек цикл с направлением обращения в течение 3 минут. Замораживать шлифовальные судна в жидком азоте. Повторите 4 раза в течение 15 минут общего времени измельчения.
  4. Сбор замороженных grindate в 50 мл Сокол трубки месте сухого льда. Хранить при температуре -80 ° С до готовности к использованию.
  5. Сделать 10мл решение 8М мочевины, 0,1 М бикарбонат аммония, 0,1 М Трис рН 8,6. Добавить 3 объема мочевины буфера 1 объем замороженных grindate (например 3mls из мочевины буфера добавляется в 1 г гранул с 1 мл PBS буфера). Сразу же разрушать ультразвуком смеси с sonicator зонда (2 - 10 секунд импульсов). Держите наконечник в нижней части трубки для предотвращения вспенивания раствора. Grindate должны немедленно отправиться в раствор.
  6. Очистить лизата центрифугированием в течение 5 минут при 4 ° C.
  7. Передача супернатант на свежий труб.
  8. Сделайте свежие аликвоту 0,5 М трис [2-карбоксиэтил] фосфин (TCEP). Добавить в образце при 1:100 для конечной концентрации 5 мМ. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 ч.
  9. Алкилирование снижается цистеина. Дать остыть до комнатной температуры. Сделайте свежие аликвоту 1M iodoacetamide. Хранить в темноте (мы обернуть трубу в фольге). Добавить в конечной концентрации 20 мМ. Инкубировать в темноте в течение 1 часа при комнатной температуре.
  10. Quench iodoacetamide с 20 мМ DTT 1M от фондового при комнатной температуре в течение 1 ч.
  11. Количественная белка со стандартным Брэдфорд или BCA анализа (не описаны). Возьмите образец для анализа с помощью SDS PAGE ниже.
  12. Для проверки включения тяжелых изотопов, используйте 100 мкл снижается и алкилированные лизат. Развести 1:4 с дН 2 O, разрушать ультразвуком и добавить в трипсин 50:1 белка трипсином. Дайджест в течение минимум 4 часов, сухой образец вниз в вакууме скорость, а затем опреснения с C18 столбцов Ultramicrospin (гнездо Group).
    1. Гидратов колонку с 100 мкл ацетонитрила
    2. Равновесие с 200 мкл 0,1% TFA.
    3. Ресуспендируют сухого образца в 200 мкл 0,1% TFA. Нагрузка на колонну. Центрифуга при температуре ~ 200 мкг или минимальной скорости, необходимые для потока через колонку.
    4. Промыть два раза с 200 мкл 0,1% TFA.
    5. Элюируются в два раза с 50 мкл 60% ацетонитрила, 0,1% TFA.
    6. Сухой образец в вакууме скорость.
    7. Ресуспендируют образца в 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты. Выполните 2 мкл на масс-спектрометре. Проверьте включение изотопно тяжелых аргинин и лизин сдвигом 10 и 8 Далтон в соответствующих т / г спектров. Включения для каждой аминокислоты должны быть в пределах от 96 - 98%.
  13. Смешайте эквивалентные суммы (мг белков) изотопически тяжелые и легкие образцы.
  14. Разбавьте образцы 1:04 с 20% метанола.
  15. Добавить трипсина на 1:200. Выдержите в течение ночи при температуре 37 ° C.
  16. Убедитесь, что пищеварение отправился в завершение СТРАНИЦА SDS. Выполните 2 и 4 мкл предварительное переваривание образца и 8D 16 мкл сообщение трипсина переварить. Визуализируйте окрашиванием Кумасси, что пищеварение завершена. Если он не является полным, разрушать ультразвуком образца с sonicator кратко кончика зонда и переварить снова трипсином.
  17. Сухой образец вниз в скорости вакцины. При сухой добавить 200 мкл с фильтром дН 2 O и вихревые до гранул переходит в раствор. Сухой образец вниз в скорости вакцины. Ресуспендируют снова дН 2 O. Сухой образец снова.
  18. Ресуспендируют гранулы в 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ; Sigma). Убедитесь, что рН составляет около 3 с помощью рН полоски. При необходимости подкисляют 10% TFA.
  19. Гранул из любой осадок.
  20. Опреснения образцов на водах Sep-Pak Vac 500 мг C18 колонке. Не перегружайте этих столбцов. Максимальная сумма составляет 5 мг, но лучше, чтобы загрузить немного меньше. Разделить между образцом несколько столбцов, если необходимо.
    1. Гидратов колонки с 5 мл на 100% ацетонитрила. Центрифуга при температуре ~ 200 мкг или минимальной скорости, необходимые для потока через колонку.
    2. Равновесия колонка с 5 мл 0,1% TFA. Нагрузка образца. Сбор потока и загрузить снова.
    3. Промыть 5 мл 0,1% TFA. Повторить.
    4. Элюции с 2 мл 60% ацетонитрила, 0,1% TFA.
    5. Сухой образец вниз в скорости вакцины.

Пептидов Фракционирование и выделение фосфопептидов

  1. Пептиды фракционируют на HILIC колонке. Мы используем Tosoh TSK-гель Амид-80 4,6 мм х 25 см аналитическую колонку с охраной колонке. Не торопитесь с этим шагом, запустить колонку в течение 2 часов при 90% запустить две пустые градиенты до загрузки вашего образца. Максимальная нагрузка на колонки такого размера, как считается, около XX, мы обычно не загружайте более 5 мг в перспективе.
  2. Растворитель - 98% ACN/0.1% TFA
    Растворитель B - 2% ACN/0.1% TFA
    Нагрузка в 90% в течение 20 ', 90% до 85% в течение 5, 85% до 60% в течение 40', 60% до 0% в течение 5 ', 0% до 90% в течение 5 '.
  3. Расход 1ml/min и фракций были собраны на 2 минуты интервалы, начиная с 85% до 60% градиент.
  4. Комбинат фракций уменьшить количество фракций до 10. Увеличение фракций, скорее всего, принесет больше охват phosphoproteome.

Обогащение фосфопептидов

  1. Фосфопептиды обогащенного использованием PHOS-Select Железный Affinity лари. Мы аликвоту нашей IMAC смолы, чтобы избежать повторного замораживания оттаивания. Сделайте 50 мл 250 мМ уксусной кислоты, 30% раствор АКС нагрузки. Довести рН до 2,7 с HCl. Ресуспендируют гранул в 500 мкл нагрузка решение. Проверьте рН, отрегулируйте с HCl или NaOH по мере необходимости.
  2. Предварительная стирка 200 мкл IMAC бисером в соответствующую графу. Мы используем Molbiotec столбцов спина.
    Добавить 15 мкл 50% раствора (гель для загрузки раствора) в каждой фракции, и инкубировать образцы для 30 'с конца по конец вращения. Держите потока для анализа.
  3. Вымойте образцы 3 раза с грузом решение и один раз с 500 мкл фильтруется дН 2 O.
  4. Элюции пептидов с 2 - 3 мин при 400 мкл 50 мМ Na 2 HPO 4 (рН 8,4) буфера. Трансфер в стеклянный пузырек.
  5. Подкисляют до рН 3 с 5 мкл 100% муравьиной кислоты, флэш заморозить в жидком азоте, и высушенного образца вниз в скорости вакцины.
  6. Ресуспендируют фосфопептидов в 200 мкл 0,1% TFA и C18 чист, как описано выше. Сухой вниз элюировали образцов в вакууме скорость.
  7. Ресуспендируют пептидов в 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты. Используйте 2 мкл на масс-спектрометре анализа или по мере необходимости.

Примечания

На протяжении большей части этого протокола вы будете работать «слепым». Лизиса клеток можно контролировать с помощью западных промокательной и Брэдфорда или BCA анализы, и пищеварение трипсина также может быть легко оценена. HILIC столбец дал след, подобный этому, или, как показано в других работах [1, 2] в зависимости от жидкой хроматографии машина, которая используется. Образцы контролируются масс-спектрометрии; тестирование образцов на недорогих машин, таких как LCQs или Мальдис перед отходом ко высокой анализ стоимости на высокой точностью массы, высокий машина разрешения. Наконец, если вы вниз сушки образца с кислотой в нем, использование стекла.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот метод даст обогащение фосфопептидов, которые могут быть количественный анализ. Число параметров может быть изменен в данном протоколе, но самый важный аспект помнить, чтобы сохранить свои фосфорилирования. Подготовка клеток для количественной может быть достигнуто в несколько различных способов, например, если вы не можете этикетку ваши клетки в живом организме, теги, например ICAT [3] или ITRAC [4] может быть использован после добычи до дифференциально этикетке двух культур для количественного целей.

...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Богатые Роджерс для оказания технической помощи с масс-спектрометрии анализа и полезные обсуждения, и д-ра. Роб-Мориц, Джефф Ranish, и Хамид Mirzai за полезные обсуждения.

Эта работа финансировалась NIH Центры компетенции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4Sigma-Aldrich608033
Isotec™ L-Lysine-15N2Sigma-Aldrich609021
GIBCO™ Фосфатно-солевой буфер (PBS) 7.4 (10X), жидкийInvitrogen70011044
Таблетки с ингибитором протеаз SigmaFASTSigma-AldrichS8820
Коктейль ингибиторов фосфатаз Pierce HaltThermo Fisher Scientific, Inc.78420
Шаровая мельница Retsch PM100Retsch20.540.0001
Стальная измельчающая чаша Retsch объемом 125 mlRetsch01.462.0148
Колонка Ultramicrospin C18The Nest GroupSUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18WatersWAT043395
Аналитическая колонка TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cmTosoh Corp.13071Это хроматографическая колонка для HILIC.
Предохранительная колонка 4.6 mm ID x 1 cmTosoh Corp.19021Мы рекомендуем использовать эту предохранительную колонку для продления срока службы вашей HILIC-колонки.
Железоаффинный гель PHOS-Select™Sigma-AldrichP9740Это смола для IMAC. Разделить на аликвоты и хранить.

Ссылки

  1. Albuquerque, C. P. A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).
  2. McNulty, D. E., Annan, R. S. Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection. Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).
  3. Gygi, S. P. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).
  4. Ross, P. L. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Gruhler, A. Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway. Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).
  6. Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of fission yeast. J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).
  7. Villen, J., Gygi, S. P. The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).
  8. Jensen, S. S., Larsen, M. R. Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques. Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).
  9. Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
  10. Pinkse, M. W. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).
  11. Tao, W. A. Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry. Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).
  12. Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation. Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).
  13. Bodenmiller, B. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

solubilization
Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.