Описание процедуры количественного фосфорилирования использованием криодеструкция, мочевина solubilziation, HILIC фракционирования и IMAC обогащения фосфорилированных пептиды.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Этот протокол описывает роста и стимулирования, с жирной олеиновой кислоты, изотопно-тяжелой и легкой клетки С. CEREVISIAE. Клетки местности с помощью криодеструкции процедура в мясорубку шаровой мельнице и в результате grindate приведены в растворе мочевины солюбилизации. Эта процедура позволяет лизис клетки в метаболически неактивное состояние, сохраняя фосфорилирования и предотвращения переориентации phosphoproteome во время клеточного лизиса. После сокращения, алкилирования, трипсина переваривание белков, образцы обессоленной на C18 колонны и образец сложности сократились на фракционирования использованием гидрофильной хроматографии взаимодействия (HILIC). HILIC колонн преимущественно сохраняют гидрофильных молекул, которые хорошо подходят для phosphoproteomics. Фосфорилированных пептиды, как правило, элюируются позднее в хроматографического профиля, чем не фосфорилированных аналогов. После фракционирования, фосфопептиды обогащенного использованием иммобилизованных металла хроматографии, которая опирается на заряд основе сродство к фосфопептидов обогащения. В конце этой процедуры образцы готовы к количественному анализу методом масс-спектрометрии.
Протокол
Клеточного роста и средств массовой информации
- Единственная колония BY4742Δarg4Δlys1 клетки на ночь в 100 мл богатых СМИ OD 600 на 1,0, то семя на две 1 л культур минимальной среде дрожжи (0,17% Дрожжи азотистого основания, без сульфата аммония или аминокислот, 0,5% сульфат аммония), содержащий полный набор аминокислот, дополнен 20 мг / л изотопически нормального или тяжелого аргинин (13 C 6 15 N 4; Isotec) и лизина (13 C 6 15 N 2; Isotec).
- Клетки выращивались в течение 18 часов, чтобы OD 600 из 1,8. Очень важно, чтобы клетки про....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот метод даст обогащение фосфопептидов, которые могут быть количественный анализ. Число параметров может быть изменен в данном протоколе, но самый важный аспект помнить, чтобы сохранить свои фосфорилирования. Подготовка клеток для количественной может быть достигнуто в несколько различных способов, например, если вы не можете этикетку ваши клетки в живом организме, теги, например ICAT [3] или ITRAC [4] может быть использован после добычи до дифференциально этикетке двух культур для количественного целей.
.......Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Богатые Роджерс для оказания технической помощи с масс-спектрометрии анализа и полезные обсуждения, и д-ра. Роб-Мориц, Джефф Ranish, и Хамид Mirzai за полезные обсуждения.
Эта работа финансировалась NIH Центры компетенции.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | |
| Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | |
| GIBCO™ Фосфатно-солевой буфер (PBS) 7.4 (10X), жидкий | Invitrogen | 70011044 | |
| Таблетки с ингибитором протеаз SigmaFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Коктейль ингибиторов фосфатаз Pierce Halt | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78420 | |
| Шаровая мельница Retsch PM100 | Retsch | 20.540.0001 | |
| Стальная измельчающая чаша Retsch объемом 125 ml | Retsch | 01.462.0148 | |
| Колонка Ultramicrospin C18 | The Nest Group | SUM SS10 | |
| Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | |
| Аналитическая колонка TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm | Tosoh Corp. | 13071 | Это хроматографическая колонка для HILIC. |
| Предохранительная колонка 4.6 mm ID x 1 cm | Tosoh Corp. | 19021 | Мы рекомендуем использовать эту предохранительную колонку для продления срока службы вашей HILIC-колонки. |
| Железоаффинный гель PHOS-Select™ | Sigma-Aldrich | P9740 | Это смола для IMAC. Разделить на аликвоты и хранить. |
Ссылки
- Albuquerque, C. P. A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).
- McNulty, D. E., Annan, R. S. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
