В этом видеоролике показано, как измерить ячейки вторжения через клеточные культуры вставками использованием флуоресценции основе методологии.
Методическая статья
В пробирке FluoroBlok опухолевой инвазии Пробирной
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Отличительной чертой метастатических клеток является их способность к вторжению через базальную мембрану и мигрировать в другие части тела. Клетки должны быть в состоянии и выделяют протеазы, которые расщепляют базальной мембраны, а также миграцию, чтобы быть агрессивным. BD BioCoat опухолевой инвазии Система обеспечивает клетки с условиями, которые позволяют оценить их инвазивных собственности
Протокол
После маркировки и измерения с использованием BD кальцеин AM флуоресцентного красителя
Клетки помечены для количественного после того как они вторглись через BD Матригель Матрицы и пропускается через мембраны BD FluoroBlok. В результате, только конечная точка измерения клеточного вторжения могут быть получены.
- Расти клетки ~ 80% слияния.
- Подготовка и увлажняет вставить системе.
- Удалите пакет от -20 ° C хранения и дайте ему прийти к комнатной температуре.
- Открытый пакет фольги и добавить 500 мкл теплой (37 ° C) СМИ интерьера вставки скважин. Разрешить пластину увлажняет в течение 2 часов при температуре 37 ° C, 5% СО 2.
Примечание: нет необходимости увлажняет немелованной BD Сокол FluoroBlok 24-многоямного Вставьте системы, которая будет использоваться в качестве контроля миграции клеток. - После регидратации, осторожно удалите среды от вставки скважин, не нарушая слой BD Матригель Матрица на мембране. Система готова к использованию.
- Подготовка клеточные суспензии по trypsinizing ячейки монослоев и ресуспендирования клеток в бессывороточной DMEM на 5 х 10 4 клеток / мл.
Примечание: Если вы используете другой тип клеток необходимо определить оптимальную плотность посева. Для определения оптимальной плотности посева для вашего типа клеток на пористой поверхности роста, использование диапазона плотности посева (клеток / см 2), что скобки плотности посева используются на непористых поверхностях (например, фляги, блюда и тарелки). Например, если вы в настоящее время семена на уровне 2,5 х 10 5 клеток / см 2, семян при различных концентрациях между ячейками 5 × 10 4 и 5 х 10 5 клеток / см 2 для определения оптимальной начальной плотности посева. - Добавить 500 мкл клеточной суспензии (2,5 х 10 4 клеток) в апикальной камер.
- Добавить 750 мкл хемоаттрактант (5% ЭТС в DMEM) к каждому из базального камеры, используя образец порты для доступа.
- Инкубируйте опухоли BD BioCoat системы Вторжение и немелованной BD Сокол FluoroBlok 24-многоямного Вставьте пластины на 20-22 часов при 37 ° C, 5% СО 2 атмосферы.
- После инкубации, осторожно удалите среды от апикальной камер. Это может быть достигнуто, вытряхнув содержимое в контейнер для отходов. Не прикасайтесь к нижней поверхности вставки системы.
- Передача вставить системы во второй 24-луночного планшета, содержащую 500 мкл / лунку 4 мкг / мл кальцеин AM в HBSS. Инкубируйте в течение 1 часа при температуре 37 ° C, 5% СО 2. Решение кальцеин AM не удаляется из нижней палаты, прежде чем читать флуоресценции, потому что это жизненно nonfluorescent краситель, который превращается в зеленого флуоресцентного кальцеин по цитозольного эстераз.
- Флуоресценция вторглись в клетках читается на длинах волн 494/517 нм (Ex / Ет) на дно чтения читатель флуоресцентные пластины. Установка усиления, возможно, должны быть определены эмпирически, но середина усиления должна быть достаточной отправной точкой. Установка усиления, что слишком высокая может привести к насыщению детектор с высокой флуоресцентные пробы; это может помешать приобретению значимых результатов. Использование AutoGain (если поддерживается вашим читателем) не рекомендуется. Перевернутой флуоресцентного микроскопа может быть использована для проверки ваших результатов, это особенно полезно, чтобы сделать это в первый раз вы запустите этот анализ.
Примечание: Крайне важно, чтобы Вставить системы можно прочитать с помощью правильную карту пластины. Для получения информации о загрузке карты пластины видеть BD Технический бюллетень № 436 от www.bdbiosciences.com или свяжитесь с BD Техническая поддержка (labware@bd.com). Правильная ориентация пластина с хорошо A1 в левом верхнем углу и логотип BD Флакон ориентированных на право, как пластина вставляется в считыватель.
Сжатие данных
Данные выражается в следующей формуле: 
Фон может быть вычтен до расчета процентов вторжение ячейки
РФС = относительная флуоресцентные единиц.
Раскрытие информации
Авторы являются сотрудниками BD Biosciences, которая производит реактивы и инструменты, используемые в этой статье.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Система для анализа инвазии опухолевых клеток BD BioCoat | BD Biosciences | 354165 или 354166 | |
| Клетки HT-1080 и NIH/3T3 | ATCC | ||
| Дульбекко’модифицированная среда Игла (DMEM; без сыворотки) | |||
| Дульбекко’фосфатно-солевой буфер без кальция и магния (DPBS) | |||
| Система инсертов BD Falcon FluoroBlok на 24 лунки, используемая в качестве контроля миграции клеток | BD Biosciences | 351157 или 351158 | |
| 5% фетальная бычья сыворотка в DMEM | |||
| Флуоресцентный краситель BD Calcein AM | BD Biosciences | 354216 или 354217 | |
| раствор Хэнкса’ Сбалансированный солевой раствор (HBSS) | |||
| 24-луночные планшеты BD Falcon для маркировки клеток после инвазии | BD Biosciences | 351147 | |
| Флуоресцентный планшетный ридер с возможностью считывания снизу | PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar. |
Ссылки
- Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-κB-regulated gene products and TAK1-mediated NF-ΚB activation. Blood. 109, 2727-2735 (2007).
- Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-κB Activation by Inhibiting IκBα Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-κB-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion. J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).
- Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. Modification of the cysteini residues in IκBα kinase and NF-κB (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-κB-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells. Blood. , 113-2003 (2009).
- Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. eguelin an Akt Inhibitor, Suppresses IΚBα Kinase Activation Leading to Suppression of NF-κB-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion. J. Immunol. , 177-5612 (2006).
- Partridge, J., Qian, S. Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model. Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. 2005 Sept 11-15, Geneva, Switzerland, , (2005).
- An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation. US patent. , 6,740,501,B2 (2004).
- Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds. Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).
- Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay. Screentech 2001 Conference. 2005 Mar 12-16, San Diego, CA, , (2005).
- Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs. Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. 1999 Sept 13-16, Edinburgh, SC, UK, , (1999).
Перепечатки и разрешения
