Method Article

Визуализация Одноместный молекулярных комплексов В Vivo Использование дополнительных флуоресцентной микроскопии

DOI:

10.3791/1508

September 8th, 2009

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы показываем, протоколы для выполнения одной молекулы флуоресцентной микроскопии на живые клетки бактерий чтобы функциональных молекулярных комплексах для обнаружения, отслеживания и количественно.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полное понимание механизмов живых клеток может быть достигнуто только путем исследования основных процессов, которые вызывают и прямой событий на клеточном уровне. На сегодняшний день сдвига сложности биологических систем вызвало точное одиночных молекул экспериментов, чтобы быть слишком требовательным, сосредоточить внимание на изучении одной системы, использующие относительно сырая масса ансамбль среднего измерений. Тем не менее, многие важные процессы происходят в живой клетке на уровне одного или нескольких молекул, ансамбль измерений обычно маски стохастической и гетерогенный характер этих событий. Здесь, используя передовой оптической микроскопии и аналитические инструменты для анализа изображений мы покажем, как контролировать белков в пределах одной живой бактериальной клетки с точностью до отдельных молекул, и как мы можем наблюдать динамику внутри молекулярных комплексов в функционировании биологических машин. Методы имеют непосредственное отношение физиологически. Они минимально-пертурбативные и неинвазивные к биологическому исследуемого образца и полностью приспособлены для исследований в живой материал, функции, не доступны для других одиночных молекул подходы биофизики. Кроме того, биологических образцов, изучил все производят флуоресцентно с метками белка на уровнях, которые почти идентичны немодифицированные штаммов клетки ("геномной кодирования»), в отличие от более общих, но менее идеальный подход для генерации значительно больше белка, чем это происходит естественным ('плазмиды выражение'). Таким образом, фактические биологические образцы, которые будут изучены значительно ближе к природных организмов, и поэтому наблюдения более актуальными для реальных физиологических процессов.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Чтобы начать эту процедуру, 50 мкл замороженные запасы флуоресцентный белок выражения кишечная палочка бактериальной клетки первого размороженные и выросли аэробно при встряхивании в 5 мл LB питательных сред ночи при 37 ° С. Утром, 50 мкл этого насыщенного культуры извлекается и суб-культурных на минимальные M63 глюкозы культуре средств массовой информации, инкубации при температуре 30 градусов С в течение 4 до 6 часов. Здесь мы показываем, с использованием двух различных штаммов клетки, одна из которых выражает электрон-транспортных цитохрома слит с GFP, другой, который выражает белок, участвующий в бактериальных жгутиков двигателя сливают с GFP.
  2. Клетки могут либ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не "за сдвига" ячейки для глядя на привязал бактерий, так как это может привести к нарушению функциональности жгутиковых моторов. Важно использовать клетки намного дольше, чем один раз на час стекло микроскопа, так как они могут стать кислород исчерпан. Значительная оптимизация может потребоваться, чтобы найти лучшие условия микроскопе изображение обслуживали вашей конкретной биологической системе ведется расследование. Может быть, стоит попытаться визуализации с исполь.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признаем рода пожертвования бактериальных штаммов из группы профессора Джудит Армитаж (Оксфордский университет, Великобритания) и профессор Конрад Mullineaux (Queen Mary Лондонского университета, Великобритания). IMD финансируется совместно отделом биохимии (Оксфордский университет) и OCISB; AR финансируется инженерным и физическим научным исследованиям Совета (EPSRC) DTC студенчества; ND финансируется из биотехнологии и биологических наук Исследовательского Совета (СИББН); MCL является финансируемых Королевского общества стипендий исследовательского университета.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes. Nature. 443, 355-358 (2006).
  2. Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule FluorescenceAdvanced Fluorescence MicroscopyLiving Bacterial CellsFluorescent Protein TaggingTotal Internal Reflection FluorescenceElectron Multiplying CameraHigh Numerical Aperture ObjectiveFluorescent Spot DetectionPhoto Bleaching AnalysisMolecular Complex Visualization

Related Articles