Мы описываем подробные процедуры для эффективной трансфекции ДНК плазмиды в волокнах мышц стопы живых мышах электропорации и последующей визуализации экспрессии белка с помощью флуоресцентной микроскопии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Трансфекция ДНК млекопитающих скелетных мышц использованием В Vivo Электропорация
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Растущий интерес к клеточной биологии заключается в выражении transgenically изменение формы необходимых белков (например, флуоресцентной меткой конструкций и / или мутантных вариантов) с целью изучения их распределения эндогенных и функциональной значимости. Интересный подход, который был реализован для выполнения этой задачи в полностью дифференцированных клеток
Протокол
Экспериментальные процедуры в естественных условиях электропорации FDB и IO мышцы
- Перед запуском в протоколах естественных электропорация, млекопитающих плазмид выражение должно быть усилено для получения концентрации в диапазоне до 2-5 мкг плазмиды / мкл ТЕ. Примечание: Мы обычно используют коммерческие наборы усиления и следовать процедурам производителя. Коммерческая плазмид выражение проведения работ ЦМВ промоутер очень хорошо в скелетных мышцах в естественных условиях трансфекции.
- Алиготе необходимого объема (10-20 мкл) плазмиды решение и сохранить его в два 0,5 мл Eppendorf трубки (по одному для каждой по....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы описываем здесь подробные шаги, которые следует соблюдать, чтобы достичь эффективной трансфекции ДНК плазмиды в скелетные мышечные волокна путем в естественных условиях электропорации. Основные преимущества нашего подхода являются простота реализации и ее минимальная инвазивность, что приводит к незначительным опасность для здоровья животных. На самом деле, описанных выше протоколов электропорации не влекут за собой гораздо больше, чем две подкожные инъекции в ногу, после чего электрический протокол стимуляц.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.
Благодарности
Мы благодарим д-р Т. Отис, Департамент нейробиологии, UCLA, для обмена TPLSM объекта с нами, д-р К. Fahlke, Институт физиологии, Аахена, Германия, за добрые пожертвования pEYFP-ClC1 плазмиды, и г-н . Р. Серрано для технической поддержки. Эта работа была поддержана грантами NIH / NIAMS гранты AR047664 и AR54816.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Ссылки
- Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery. Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Voltage-....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
