Мы описываем роман красный флуоресцентный белок (RFP) репортеру, что выражается в частности в Drosophila Глаза. Мы подробно методология рассечения глаз имагинальных дисков, и как это репортер может быть использована для помощи в вскрытие и идентификация специфических типов клеток в развивающемся глазу.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Репортер Роман ППП в помощь Визуализация глаз имагинальных дисков в Drosophila
В этой статье
Краткое содержание
Протокол
- Первое место капля PBS на блюдо Sylgard при вскрытии микроскопом.
- Далее удалить несколько блуждающих третьего возраста личинок из флакона или бутылки с помощью шпателя и поместите их в PBS.
- Для начала вскрытия использовать левую пинцетом рукой (если вы правша), чтобы понять личинки две трети пути к задней, а затем использовать другую пару провести темные крючки рот на переднем конце.
- Теперь осторожно потяните личинки, кроме, перемещая обе пары пинцетом друг от друга. Ротовые должны прийти от остальной части тела с глаз / мозга комплекс прилагается.
- Для окраски глаз диски для иммунофлюоресценции исправить дисков на данный момент, поместив их в 4% параформальдегид / PBS решение в течение 30-45 минут на льду. Затем промыть дисков в четыре раза с PBST и пятна, то с соответствующими антителами.
- Проще всего анализировать глаз диски прямо на слайде. Место падения ФСБ на предметное стекло и перемещать диски в капле PBS, удерживая ротовые.
- Имагинальных ткани полупрозрачные и поэтому на первый взгляд диски трудно идентифицировать. Чтобы было легче идентифицировать их использование рассекает микроскопом с флуоресцентной способности. Использование глаз RFP репортер линии глаз диски хорошо видно, как красные флуоресцентные ткани наложения сферических оптических долях (рис. 1).
- Если вы используете оптоволоконный источник холодного света направлять свет под косым углом к слайду, так как это даст диски большего контраста. Глаз / усиков диски крепятся к оптической долями через глазной стебель на задней и ротовые через стебель ближайшие от усиков диск на переднем.
- Чтобы рассечь глаз диски содержат ротовые используя один пинцет и использовать другую пару отделить глаз диски от личиночной мозга. Следующая отдельные глаз диски от ротового. Наконец удалить из ротового слайд так как они могут предотвратить покровное от лежа.
- Если у вас есть расчлененный все диски глаз мягко наклона слайдов и высушить избыток PBS. Затем добавьте каплю Vectashield и осторожно положите покровное на вершине.
- Диски готовы для включения в образ либо epifluorescence или конфокальной микроскопии (рис. 2).
Результаты представитель
Когда правильно расчлененные глаз / усиков диск должен лежать на слайд подальше от посторонних тканей, таких как мозг. Спинной и брюшной полюса глаза диск изогнуты и поэтому, как правило, раза, но этого можно избежать, приняв Z-серии по конфокальной микроскопии и опуская эти разделы с проекцией. Хотя диск однослойный эпителий переменная положений ядер требует Z-серии проекции, чтобы получить общее представление о диске. Проекция типичной для глаз RFP глаз / усиков диск приняты на конфокальной микроскопии показано на рисунке 2. Мы обычно принимают по 1 мкм срезы через диск с помощью 20x или 40x объектива. Глаза RFP репортер ядерной локализованы и поэтому картина показано на рисунке 2 представляет ядер клеток, экспрессирующих ППП.
Рисунок 1. Первоначальное вскрытие глаз / мозг комплекса из глаз RFP третьей взрослой личинки дрозофилы. Глаз / усиков имагинальных дисков (очерчен) можно увидеть придается ротовые (МП) и наложения оптической доли (ПР) головного мозга. Изображение было получено использованием флуоресценции рассекает микроскопом, чтобы показать, выражение ППП в глаза диска. Передняя находится слева. Шкала бар: 300 мкм.
Рисунок 2. Выражение глаз RFP репортером в глаза имагинальных дисков. Третий глаз возраста (ED) / усиков диск (AD), расчлененные от глаз ППП ППП личинки показывает выражение (красный). Диск был залит фаллоидином (зеленый), что пятна апикальной поверхности клеток и показывает морфогенетических борозды (стрелки). ППП выражается в клетки-предшественники вокруг М.Ф., в фоторецепторы 1,6,7 и колбочек. Передняя находится слева. Шкала бар: 25 мкм.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Препарирование диска Drosophila глаз имагинальных прост, но может занять много времени для освоения. Критические шаги идентификации диска глаза и его рассечение от личиночной мозга. Определение глаз диск облегчается использованием глаз RFP линии описано здесь. Возможные модификации для удаления усиков диск или peripodial мембраны, или покинуть зрительный доли прилагается к себе PR аксонов попадания в мозг.
Глаза RFP линия была создана путем клонирования роман глаз конкретных усилите...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Эта работа финансировалась Королевского колледжа в Лондоне и Королевского общества.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Ссылки
- Doroquez, D. B., Rebay, I. Crit Rev Biochem Mol Biol. 41 (6), 339-339 (2006).
- Kaul, A. K., Craig, G. M., McNeill, H., Bateman, J. M. , Forthcoming.
- Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. Biotechniques. 36 (3), 436-436 (2004).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
