Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Визуализация РНК Локализация в Xenopus Ооцитов

11.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/1704

⸱

14 января 2010 г.

 , 
1Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Визуализация В естественных условиях РНК транспорта осуществляется путем микроинъекции флуоресцентно меченных транскриптов РНК в Xenopus Ооцитов, а затем с помощью конфокальной микроскопии.

Аннотация

РНК локализация сохраняется механизм формирования клеточной полярности. Vg1 мРНК локализуется на растительном полюса Xenopus laevis ооциты и действует на пространственно ограничить экспрессии генов Vg1 белка. Жесткий контроль Vg1 распределение таким образом, необходимо для правильного выбора слой зародыша в развивающемся эмбрионе. РНК последовательности элементов в 3 'UTR мРНК, Vg1 локализации элемента (VLE) необходимы и достаточны для прямого транспорта. Для изучения признание и транспортировки Vg1 мРНК в естественных условиях, мы разработали изображений метод, который позволяет обширный анализ транс-фактора направлено транспортных механизмов с помощью простого визуального считывания.

Чтобы визуализировать локализацию РНК, мы синтезировать флуоресцентно меченных VLE РНК и microinject эту стенограмму в отдельные ооциты. После ооцитов культуры, чтобы перевозки вводили РНК, ооциты являются фиксированными и обезвоженные до визуализации с помощью конфокальной микроскопии. Визуализация модели локализации мРНК обеспечивает считывание для мониторинга полный путь РНК транспорта и для выявления роли в управлении РНК транспорта для цис-действующих элементов в стенограмме и транс-действующих факторов, которые связываются с VLE (Lewis и соавт., 2008, Messitt и соавт., 2008). Мы расширили эту технику в рамках совместного с дополнительной локализации РНК и белков (Ганьон и Моури, 2009, Messitt и соавт., 2008), а в сочетании с нарушением моторных белков и цитоскелет (Messitt и соавт., 2008), чтобы исследовать механизмы, лежащие мРНК локализации.

Протокол

Часть 1: Транскрипция флуоресцентно меченных мРНК.

  1. Линеаризации плазмиды ДНК, содержащей элемент РНК локализации или другие соответствующие последовательности и ресуспендирования на 1 мкг / мкл DEPC обработанных H 2 O. ДНК шаблоне должен быть выше по течению сайтов промотор для транскрипции Т7, SP6, или T3 РНК-полимеразы.
  2. Добавить следующие реагенты для стерильного 1,5 мл трубки:
    a. 10X Tx буфере (см. М & М) 2 мкл
    b. 20X шапка / NTP смеси (см. М & М) 1 мкл
    c. 1 мМ Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen) 1 мкл
    d. UTP, [α-32 P] (1 мкКи / мкл) (Perkin Elmer) 1 мкл
    e. DEPC-H 2 O 11 мкл
    f. 0,2 М ДТТ 1 мкл
    g. RNasin (Promega) 1 мкл
    час линейная ДНК-матрицы 1 мкл
    i. РНК-полимеразы (Promega) 1 мкл
  3. Смешайте реагенты мягко и центрифуга кратко (10 сек. В микроцентрифужных).
  4. Инкубируйте в течение 2-4 часов при 37 ° C, покрытие трубы с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фотообесцвечивания флуорофора.
  5. Добавить 1 мкл 1 мг / мл РНКазы без ДНКазы (Promega) деградировать шаблона ДНК.
  6. Инкубировать 15 минут при температуре 37 ° C.
  7. Добавить 79 мкл 20 мМ ЭДТА (рН 8,0), чтобы остановить реакцию.
  8. Удалить 1 мкл в отдельную трубу, помеченные как "вход" и сохранить.
  9. Спиновые реакции через 1 мл G50 колонке (см. Материалы и методы), который будет включать неинкорпорированных нуклеотиды, исключая полное мРНК длиной.
  10. Концентрат РНК этанолом осадков:
    1. Добавьте 250 мкл 100% этанола, 10 мкл 7М CH 3 COONH 4, 1 мкл носителя РНК (тРНК дрожжей, 10 мкг / мкл) или 1 мкл гликогена (20 мг / мл).
    2. Хорошо перемешать и заморозить до твердого при -80 ° С в течение> 30 минут или на сухом льду в течение 15 минут.
    3. Спиновые на максимальной скорости в микроцентрифужных течение 15 минут, сцедить супернатант.
    4. Промыть 150 мкл 75% этанола.
    5. Спиновые в течение 3 минут при максимальной скорости в микроцентрифужных, переливать супернатант.
    6. Сухие гранулы при температуре 37 ° С в течение 3 минут, чтобы все этанола не испарится.
  11. Ресуспендируют в 11 мкл DEPC-H 2 O и удалить 1 мкл до отдельной трубки, помеченные как "включено".
  12. Определить процент включения и разбавленных РНК до 50 нм (см. Материалы и методы расчета).
  13. РНК должны быть заморожены в 5 мкл аликвот, для одноразового использования, чтобы избежать циклов замораживания / оттаивания и может храниться в течение нескольких недель при температуре -80 ° C.

Часть 2: Подготовка к Микроинъекция.

  1. РНК приготовления:
    Оттепель аликвоту РНК (50 нм) и денатурации РНК при 70 ° С в течение 3-5 минут. Спиновые в течение 10 минут при комнатной температуре микроцентрифужных на максимальной скорости, чтобы удалить твердые частицы, и держать на льду.
  2. Подготовка ооцитов:
    1. Хирургическим путем удалить яичники из Xenopus laevis женщин (НАСКО).
    2. Обрезать куски яичников Xenopus laevis в 50 мл коническую пробирку с 25 мл коллагеназы решения (см. Материалы и Методы).
    3. Встряска мягко при 18 ° С в течение 15 минут, или пока ооцитов заметно отделен от яичника. Из-за партии к партии вариации, коллагеназы время лечения может варьироваться и должны находиться под тщательным наблюдением через визуальный осмотр с целью обеспечения defoliculation.
    4. Разрешить ооцитов, чтобы обосноваться в трубу, удалить раствор и промыть ооциты с буфером MBSH (см. Материалы и Методы).
    5. Повторите мыть два раза больше, в общей сложности три стирок. Этот протокол ооцитов изоляции аналогичен подробно изложены в Cohen и соавт., 2009.
    6. Вручную рода этап III / IV ооцитов (Дюмон, 1972) в MBSH буфера при стандартных рассекает микроскопом. Стадия III ооцитов полностью непрозрачны, но белый, в то время этапа IV ооцитов чуть больше, и с крапинами с пигментом. Ооцитов, которые немного прозрачной слишком молоды и ооцитов, которые полностью пигментированные или выставлять поляризованным распределением пигмента слишком стары.
  3. Иглы Способ приготовления:
    Вытяните и конические иглы наружный диаметр ~ 0,05 мм. (Мы используем Драммонд Научно 3,5-дюймовый капилляров (приказ № 3-000-203-G / X), инструмент Саттер Ко микропипетки съемник и WPI Инк beveller.)

Часть 3: Микроинъекция

  1. Калибровка игла с DEPC-H 2 O для доставки 2 п на инъекцию. Мы нагрузка на переднюю нашей иглу использованием газа управляемой microinjector (см. Материалы и методы), и калибровки падение размера с помощью микрометра.
  2. Нагрузка РНК в иглу.
  3. Место отсортированы ооцитов в инъекции блюдо с MBSH буфера. Мы microinject на блюдо слой черного поролона. Бледно ооцитов выделяются также на белом backgrouй.
  4. Внимательно вводить каждый ооцит с 2 п РНК при 50 нМ.
  5. Выгнать РНК, промойте иглу с DEPC-H 2 O, и загрузить следующий РНК для инъекций.

Часть 4: ооцитов культуры

  1. Место ооцитов в скважине стерильные 24-луночного планшета (Sigma Aldrich). Мы культуры до тысячи яйцеклеток на лунку.
  2. Удалить буфера и заменить 400 мкл О ocyte C ulture М edium (ОСМ, см. Материалы и методы) на лунку. Место культуры пластины внутри герметичный пластиковый контейнер с мокрым бумажным полотенцем, чтобы сохранить влажную среду во время культуры.
  3. Инкубируйте ооцитов при 18 ° С в течение временных точках в диапазоне от 8 до 48 часов.

Часть 5: фиксация, обезвоживания и хранения ооцитов

  1. Сортировать любые мертвые ооцитов и место выживших ооцитов в стеклянных флаконах. Мы регулярно наблюдаем> 90% выживаемости.
  2. Место ооцитов в MEMFA фиксатором (см. Материалы и методы) и рок-течение 20 минут. Защита ооцитов от света, покрывая с алюминиевой фольгой.
  3. Вымойте ооцитов путем удаления фиксатора и замена с равным объемом MBSH буфера. Повторите это еще раз мыть в общей сложности два стирок.
  4. Вымойте ооцитов в безводном метаноле:
    1. Удаление половины объема, заменить метанол.
    2. Повторите шаг "" в два раза.
    3. Удалите все решения, заменить метанол.
    4. Повторите метанола стирки.
  5. Ооциты могут храниться при температуре -20 ° С до готовности изображения.

Часть 6: Локализация РНК изображений с помощью конфокальной микроскопии

  1. Перед изображения, добавлять Клиринговый Средний Мюррей ы (2:1 бензилбензоата-бензилового спирта), чтобы FluoroDish стеклянным дном (WPI Inc) для покрытия изображения поверхности.
  2. Тщательно передачи ооцитов из метанола, FluoroDish, сводя к минимуму объем метанола переданы.
  3. Изображение на перевернутую конфокальной микроскопии (Мы успешно использовали Zeiss LSM510 и Leica TCS SP2).

Рисунок 1
Рисунок 1:.. Визуализация субклеточных Локализация РНК Микроинъекция флуоресцентно меченых стенограммы А. После микроинъекции, РНК помечена Alexa Fluor 546 изначально ограничен ядром В. После восьми часов культуры, флуоресцентно меченных контроль РНК можно увидеть равномерно распространяется в цитоплазме яйцеклетки. C. Однако, флуоресцентно меченой РНК содержащие последовательности, которые вербуют транспортного машиностроения можно увидеть в процессе внутриклеточной локализации растительного полюса яйцеклетки (в направлении снизу). Шкала бар = 50 мкм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы представили протокол для визуализации локализации мРНК в ооцитах Xenopus. Этот метод, с помощью флуоресцентно меченных РНК-транскрипты имеет более высокое отношение сигнал-шум, чем ранее полученные с дигоксигенин меченных стенограммы и проще, и быстрее, чем на месте подход (Моури и Мелтон, 1992, Гаутро и соавт., 1997). Используя этот метод, мы можем инженер РНК последовательности мутаций и быстрого теста для прижизненного функции. Кроме того, с помощью дополнительных Alexa-UTP флуорофоров, нес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Эксперименты с использованием лабораторных животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными Университете Брауна.

Благодарности

Наша работа по локализации РНК при поддержке гранта NIH (R01GM071049) для KLM.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

10X буфера Tx

  • 60 мМ MgCl 2
  • 400 мМ Трис-HCl (рН 7,5)
  • 20 мМ спермидина-HCl

20x шапка / NTP смеси

  • 10 мМ CTP
  • 10 мМ ATP
  • 9 мм UTP
  • 2 мМ GTP
  • 20 мМ G (ППС) G Cap аналоговый (New England Biolabs)

G-50 колонке

  • Гидратов 5 г Сефадекс G-50 бусин (Sigma Aldrich) в 100 мл деионизированной H 2 O. DEPC лечению в течение 30 мин. и автоклав. Магазин неполный запас при комнатной температуре. Перед употреблением добавить следующие РНКазы без решения:
  • 0,5 мл 0,2 М ЭДТА
  • 1 мл 1 М Трис рН 8,0
  • 0,5 мл 20% SDS
  • Магазин полный G-50 решение при 4 ° C.
  • Удаляют поршень от 3 мл шприцем (BD Biosciences) и поместите баррель шприца в 15 мл коническую трубку (Corning). Вставьте шприц с небольшим количеством стекловаты (плагин около половины размера копейки).
  • Swirl полный G-50 решение для ресуспендирования бисером.
  • Добавить 2 мл G-50 решение пустой столбец.
  • Спиновые течение 1 минуты при 1000 х г в центрифуге настольный.
  • Добавить 200 мкл DEPC обработанных деионизированной H 2 O для каждого столбца. Spin.
  • Повторите мыть два раза больше, в общей сложности три стирок.
  • Удалите шприц баррель до 15 мл свежего коническую трубку.

Коллагеназа решение

  • 75 мг коллагеназы из Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich)
  • 25 мл 0,1 М КПО 3 + (рН 7,4)

MBSH буфер

  • 88 мМ NaCl
  • 1 мМ KCl
  • 2,4 мМ NaHCO 3
  • 0,82 мМ MgSO 4 x 7H 2 O
  • 0,33 мМ Ca (NO 3) 2 X 4H 2 O
  • 0,41 мМ CaCl 2 х 6H 2 O
  • 10 мМ HEPES (рН 7,6)

Средний ооцитов культуры

  • 50% L15 среда
  • 15 мМ HEPES (рН 7,6)
  • 1 мг / мл инсулина
  • 100 мг / мл гентамицина
  • 50 ед / мл нистатина
  • 50 ед / мл пенициллина
  • 50 мг / мл стрептомицина

MEMFA решение

  • 0,1 М MOPS (рН 7,4)
  • 2 мМ EGTA
  • 1 мМ MgSO 4
  • 3,7% формальдегида

Вычислительная РНК выход

  • Определите CPM в "вход" и "включить" образцы с использованием стандартного сцинтилляционного счетчика.
  • Включение = ("включено") / (10 х "вход")
  • Типичные значения включению в диапазоне от ~ 0,03 и 0,10.
  • Максимальная теоретическая доходность для разных полимераз:
    T7, T3, SP6 - 2,64 мкг
  • Реакция выхода в мкг = (максимальный выход полимеразы используется) X (включение)
  • Развести РНК до 50 нм = (мкг РНК) / 320 / (длина РНК в базах) / (5x10 -8)
  • Реакция обычно дает ~ 50-100 мкл РНК на 50 нм.

Ссылки

  1. Cohen, S., Au, S., Pant, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. JoVE. 24, (2009).
  2. Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J. Morphol. 136, 153-179 (1972).
  3. Gagnon, J. A., Mowry, K. L. RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs. Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).
  4. Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes. Development. 124, 5013-5020 (1997).
  5. Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes. Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).
  6. Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes. Dev Cell. 15, 426-436 (2008).
  7. Mowry, K. L., Melton, D. A. Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes. Science. 255, 991-994 (1992).
  8. Yoon, Y. J., Mowry, K. L. Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin. Development. 131, 3035-3045 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes
Posted by JoVE Editors on 6/10/2011. Citeable Link.

null

Теги

Флуоресцентная РНКмикроинъекцияконфокальная микроскопиямРНК Vg1РНК VLEкультура ооцитовфиксация и обезвоживаниемоторные белки
Визуализация РНК Локализация в Xenopus Ооцитов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.