Окно в микромире: Простой микрожидкостных систем для изучения микробных транспорта в пористых средах

Summary

Микрожидкостных устройств могут быть использованы для визуализации сложных природных процессов в режиме реального времени и соответствующие физические масштабы. Мы разработали простую микрожидкостных устройство, которое имитирует ключевые особенности природных пористых средах для изучения роста и транспортировки бактерий в подземных.

Abstract

Микробная роста и транспорта в пористых средах иметь важные последствия для качества грунтовых и поверхностных вод, утилизации питательных веществ в окружающую среду, а также непосредственно для передачи патогенов к питьевой воде. Природные пористые среды состоит из сложной физической топологии, разнообразная химия поверхности, динамические градиенты питательных веществ и акцепторов электронов и неоднородное распределение микробов. Эти особенности существенно различаются на масштабе микрон, что делает результаты макромасштабе исследования микробных транспорта трудно интерпретировать, и проверка механистической модели сложной задачей. Здесь показано, как простые микрожидкостных устройств могут быть использованы для визуализации микробных взаимодействий с микро-структурированных сред обитания, определить ключевые процессы, влияющие на наблюдаемые явления, а также систематически проверки прогностических моделей. Простой, легкий в использовании клетки потока были построены из прозрачных, биосовместимых и кислородно-проницаемого материала поли (диметил силоксан). Стандартные методы фотолитографии были использованы для микро-структурированных мастеров, и реплики литья была использована, чтобы бросить микро-структурированных клетках поток от мастеров. Физическое проектирование камеры проточной кюветы может адаптироваться к экспериментальным требования: микроканалов может варьироваться от простого линейного соединения сложных топологий с функцией размером до 2 мкм. Наши модульные EcoChip поток массив ячеек представлены десятки идентичных камер и управление потоком по тяжести управляемой потоком модуля. Мы показываем, что за счет использования устройств EcoChip, физических структур и давление головки могут быть постоянными или разнообразные систематически в то время как влияние химии поверхности, свойства жидкости, или характеристики микробного населения исследуется. Через транспортные эксперименты с использованием непатогенных, зеленый флуоресцентный белок, экспрессирующих

Protocol

И. микрожидкостных устройств Изготовление

1. Первым шагом в создании микрожидкостных устройств является привлечение двумерной расположение устройства в компьютер помогает рисование (CAD) программ. Мы использовали AutoCAD, но и других графических программах, также доступны, такие как CleWin или CorelDraw.
2. Следующий шаг заключается в изготовлении фотолитографии маску. В зависимости от устройства размеры, необходимые разрешения и бюджета, эти маски могут быть изготовлены в хром (высокое разрешение, высокая стоимость), созданный на фотопленку или даже печатать непосредственно на накладные прозрачности с использованием принтер высокого разрешения. Здесь мы использовали Cr маски производства Advance Репродукции корпорации, Северной Андовер, штат Массачусетс.
3. Следующим шагом является передача картины от маску на светочувствительной эпоксидной создать подняли сброса формы.
   1. Во-первых, слой фоторезиста отрицательные SU8 вращается на силиконовых пластин до требуемой толщины, и запеченные для испарения избыточной растворителя. Фоторезист разработке и спина скоростях контроль толщины осажденного слоя.
   2. Затем шаблон подвергается заранее определенной дозы УФ-света через маску. Постконтактной запекать перекрестные ссылки свете, подвергшихся воздействию районов фоторезиста покрытием, что делает их неразрешимыми.
   3. Далее идет развитие шаг, где неэкспонированные сопротивляться удаляется с химическими разработчиков, оставляя положительные подняли сброса структуру, называемую мастера.
   4. Третий этап выпечки называют жестким шагом выпекать не является обязательным для дальнейшего исправления структуры.
4. PDMS литье
   1. Мы используем силиконового эластомера поли (диметил силоксан) для реплики формования микрожидкостных устройств ^1. Во-первых, основной материал смешивается в 10:01 весу с отвердителем, облили плесени в мелкий контейнер, такой как чашке Петри, а при их дегазации с вакуумным пока все видимые пузырьки исчезли.
   2. Мастер с неотвержденного PDMS затем помещается в печь тщательно выровнена, по крайней мере 4 часа при температуре 65 ° С для сшивания полимера, чтобы произойти.
   3. После PDMS затвердевает, формованные разделе вырезается из чашке Петри. Отверстия пробиваются через верхнюю часть устройства для доступа к микрожидкостных пространства в готовом устройстве.
5. Привязанность к стекла
   1. Чистая PDMS необратимо связана с чистой стекла под воздействием кислородной плазмы. Во-первых, литой и ударил PDMS и чистой предметное стекло помещают связи поверхностью вверх в плазме чище. Мы использовали PDC-32G Harrick плазмы чище.
   2. После закрытия камеры, оператор включается вакуумный насос, а затем радиочастоты или ВЧ источника. Плазменные будет самостоятельно зажечь в камере, о чем свидетельствует слегка фиолетовым свечением в камере.
   3. После контакта с плазмой в течение 30 секунд, ВЧ источника, а затем вакуумный насос отключается.
   4. Быстро, предметное стекло и PDMS устройства удаляются из камеры и привел в непосредственном контакте (формованные PDMS боковой поверхностью вниз). Это сформирует необратимые связи, а также сделает свойств поверхности гидрофильной.
   5. При желании, различных химических поверхности может быть достигнуто с PDMS путем иммобилизации белков на поверхности путем адсорбции или ковалентные связи.
   6. Устройство может быть заполнен жидкостью, такие как деионизированной воды, питательных сред, или искусственных подземных вод капиллярные силы или ее применения как мягкое давление с помощью шприца.

II. Поток Количественная микрожидкостных устройств путем гравиметрического анализа

1. Для калибровки давления управляемых потоков в устройстве, микро-структурированных клетках поток впервые с предустановленной воды DI.
2. Жидкости, содержащей водохранилища, такие как пластиковый шприц или потока модуля (рис. 1) подключается к вышестоящему входе хорошо, и высота жидкости в резервуаре поддерживается выше высоты вниз по течению хорошо.
3. Образцы, собранные на отходы и через регулярные промежутки времени и взвешивали на аналитических весах.
4. Наклон кривой построения общего объема против общего времени дает средний объемный расход (рис. 2). Мы обнаружили, воспроизводимые, линейные средние скорости для широкого круга руководителей и давление для различных поддержания давления системы.

III. Визуализация потока, скорость карт, а также Гидрофильные / гидрофобные взаимодействия

1. Для калибровки модели, 3 мкм люминесцентные бусины латекса в обоих Карбокси Ю. и Ю. Г. Обычная поверхность были приобретены у Polysciences, Inc и разводили в воде DI с концентрацией 0,01% твердых веществ.
2. Бисер, протекающий через места обитания были визуализированы на Zeiss Axiovert 25 флуоресцентный микроскоп оснащен Mightex до н.э.-B013-U монохромные камеры.
3. Отдельные кадры были захвачены в быстрой последовательности и собраны в кино вместе с пакетом программного обеспечения ImageJ (рис. 3).

IV. Микрожидкостных устройств (EcoChip) для моделирования роста бактерий и транспорта

1. Vibrio зр. GFP Кан, непатогенные зеленый флуоресцентный белок, экспрессирующих организм был выращен в течение 14 часов в Лурия-Бертани средней концентрацией около 10 ⁹ клеток / мл.
2. Бактерии в ростовую среду были введены в устройствах EcoChip и позволили, чтобы колонизировать устройство и установить хлопьев и фильмы ночь в течение 19 часов.
3. Затем рост средств массовой информации была удалена из скважин, и все места обитания были сброшены с искусственной морской водой (см. Wang и соавт. ² для рецепта ASW), так что разные плотности бактерий, оставшихся в различных местообитаниях.
4. Один обитания хранился запечатанный, не поток, в то время как медленный поток условия поддерживались в 3 других мест обитания.
5. Флуоресцентные и белый свет фотографии роста бактерий были взяты каждые 15-20 часов в течение нескольких дней (рис. 4).

Результаты В. представитель

Поток модуль обеспечивает простое средство для регулирования и распределения потоков через множество сред обитания. Гравиметрический анализ оказался легким и простым способом, чтобы определить скорость потока через обитания структур, которые зависят от гидравлического сопротивления среды обитания и перепадов давления между входом и выходом скважины. Для бусинка экспериментов потока мы наблюдали гораздо больше, бусинка накопления на поверхности устройства для uncarboxylated шариков (рис. 2). Кроме того, больший диаметр бусин, 6 и 10 мм, было гораздо больше шансов стать вовлеченного в меньшие отверстия поры и начинают накапливаться в устройстве. Более высокая скорость потока снижается удержания частиц и увлечения.

Во время экспериментов бактерии роста, влияние потока условиях очевидной. Непрерывные усилия сдвига причиной бактерии для объединения вместе и образуют хлопья, и следует искать не в виде отдельных клеток. Транспорт большого бактериальных хлопьев является важным экологическим процессом, который очень трудно учиться в макроскопической системы.

Рисунок 1. Схематическое изображение функции и операции потока модуля.

Рисунок 2. Расход через структурированную среду обитания, как это определено гравиметрического анализа для различных высот столбцов. Колонка высотой соотношение: 60 / 40 = 1,5, определяется отношением скорости потока: 1,04 / 0,71 = 1,46. Приведенные расхода для H = 40 мм, V = 0,71 мкл / мин, а для Н = 60 мм, V = 1,04 μ л / мин. Расчетная средняя линейная скорости 3,1 мм / с и 4,6 мм / с соответственно.

Рисунок 3. Перевозка 3УМ бисером латекса с и без карбоксилирования, протекающий через структурированных сред обитания.

Рисунок 4. Изменение бактериального роста и образования биопленки в зависимости от плотности семян в присутствии медленного течения.

Discussion

Система EcoChip является адаптируемой к потребностям отдельного эксперимента. Новые мастера могут быть созданы относительно легко, и как только мастера изготавливают, дополнительные точно репликации устройства могут быть поданы по мере необходимости. Поток модуль прост в использовании, не требует специального оборудования или сложных соединений, и может быть смоделирована как простое падение напора система, управляемая потоком. Дополнительные расширения для этой работы продолжаются, и включают в себя создание гуминовых ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning
SU8-2025	MicroChem Corp.
Флуоресцентные бусины	Polysciences, Inc.