Экспрессия рекомбинантных белков в метилотрофных дрожжей Pichia pastoris</em

Краткое содержание

Протокол описывает экспрессии белка использованием метилотрофных дрожжей Pichia pastoris. Подготовка electrocompetent дрожжевых клеток, превращение вектора с геном интерес в П. pastoris И очистки ДНК дрожжей, также выполняются. Вестерн-блот анализе и очистки белков построить последних шагов в этом протоколе экспрессии белка.

Аннотация

Экспрессии белка в микробной эукариотических pastoris Pichia хозяин предлагает возможность генерировать большое количество рекомбинантного белка в быстрой и простой в использовании системы экспрессии.

Как одноклеточных микроорганизмов P. pastoris легко манипулировать и быстро растет на недорогих средств массовой информации при высокой плотности клеток. Будучи эукариот, П. pastoris способен выполнять многие из пост-трансляционной модификации выполняются выше эукариотических клеток и получены рекомбинантные белки проходят сворачивания белка, протеолитической обработки, формирование дисульфидных связей и гликозилирования [1].

Как метилотрофных дрожжей P. pastoris способна метаболизм метанола в качестве единственного источника углерода. Сильный промотор для алкоголя оксидазы, AOX1, жестко регулируется и индуцированной метанола и его используют для выражения гена. Соответственно, выражение чужеродный белок может быть вызвано добавлением метанола в среде роста [2, 3].

Другим важным преимуществом является выделение рекомбинантного белка в питательной среде, используя сигнал последовательности целевой чужеродный белок в секреторный путь pastoris П.. Только с низким уровнем эндогенного белка выделяется в СМИ дрожжей себя и без добавления белков в средствах массовой информации, чужеродного белка строит большинством голосов от общего белка в средних и облегчает следующие этапы очистки белков [3, 4].

Вектор, используемый здесь (pPICZαA) содержит промотор для AOX1 жестко регулируется, метанол-индуцированной экспрессии гена интересов; α-фактора секреции сигнал для секреции рекомбинантного белка, ген Zeocin сопротивления для отбора в обоих E. палочки и Pichia и С-концевой пептид, содержащий с-Myc эпитопа и polyhistidine (6xHis) теги для обнаружения и очистки рекомбинантного белка. Мы также показываем, западные блот-анализ рекомбинантных белков с использованием специфических Anti-Myc-HRP антител признавая с-Myc эпитопа на родительском вектор.

Протокол

Экспрессия рекомбинантных белков в метилотрофных дрожжей Pichia pastoris

Перед началом этого протокола вы должны иметь ваш интерес гена клонировали в кадр в P. pastoris вектор родителя и его последовательность, чтобы проверить правильность вставки из интересующего гена в вектор.

Этап I: создание electrocompetent дрожжевых клеток, линеаризация построить и превращения в П. pastoris

На этом этапе вам необходимо иметь следующие средства массовой информации и пластин под рукой:

• YPDS пластин
• 600 мл YPD среда
• ледяной стерильной воды
• 1 М сорбит
• Amicon Ультра-4 центробежный фильтр устройства
• Микроконтроллер YM-30 центробежный фильтр группы
• 0,2 см электропорации кюветы
• 15 мл стерильной стеклянной трубки
• стерильной стеклянной пипетки Пастера
• YPDS чашки, содержащие Zeocin

Часть 1: Подготовка electrocompetent дрожжевых клеток

1. За четыре дня до предполагаемого преобразования полоса из P. pastoris клеток на YPDS пластины без Zeocin, и пусть они растут 30 ° С в течение 1-2 дней или до единой формы колоний.
2. За два дня до предназначена преобразования растут 5 мл вашей P. pastoris напряжение в YPD среды в трубке 50 мл Сокол при температуре 30 ° С в течение ночи. Поместите пробирку Сокол в колбе, чтобы исправить это в шейкере.
3. За день до преобразования привить 500 мл свежего YPD среде в 2-литровую колбу с 0,25 мл ночной культуры и пусть растут ночь снова в шейкере при 30 ° С до OD ₆₀₀ = 1.3-1.5.
   Примечание: разбавить ваш образец перед измерением на спектрофотометре, чтобы получить точный результат.
4. День преобразования имеют ледяной стерильной водой и 1 М сорбит под рукой. Центрифуга клетки при 1500 мкг в течение 5 минут при 4 ° C. Ресуспендируют гранулы 500 мл ледяной, стерильная вода.
5. Центрифуга клетки снова шагу 4. Ресуспендируют гранул на 250 мл ледяной, стерильная вода.
6. Центрифуга клетки снова, как в шаге 4. Ресуспендируют гранул в 20 мл ледяной 1 М сорбит.
7. Центрифуга клетки снова, как в шаге 4. Ресуспендируют гранул в 1 мл ледяной 1 М сорбита в конечном объеме ~ 1,5 мл. Магазин клетки на льду или при температуре 4 ° С до последующего использования.
   Примечание: мы готовим более electrocompetent клеток, чем необходимо, и хранить их в аликвоты 80 мкл в микроцентрифужных трубы при температуре -80 ° C. Мы используем клетки хранятся не более чем на один месяц.

Часть 2: Линеаризация и концентрации pPICZαA построить

Для преобразования линеаризовать вектор, содержащий ваш интерес гена ограничением переварить. Мы используем фермента PmeI. Другие сайты рестрикции возможны. Вы должны убедиться, что вставка не содержит ограничений на которую требуется использовать для линеаризации ваш вектор. Для превращения в П. pastoris вам нужно 5-20 мкг линеаризованной ДНК в 5-10 мкл стерильной воды.

Также линеаризацию, сосредоточиться и передачи простой вектор (не вставка) в P. pastoris. Родителя вектор без вставки для фонового изображения внутриклеточной экспрессии и позволяет интерпретировать ваши результаты выражения.

1. Оттепель все реагенты на льду, объединить следующие реагенты и кратко центрифуге трубки, чтобы получить все жидкости на дно, водопроводной трубе и спина еще раз:
   • х мкл стерильной воды
   • 5,0 мкл 10X 4 NEBuffer
   • 0,5 мкл BSA 100X
   • до 2 мкг векторной ДНК (~ 100 нг / мкл)
   • 2,0 мкл PME я ферментом смеси
   → 50 мкл общий реакционный объем
   Примечание: для получения достаточных линеаризованной ДНК вектора подготовить выше смешайте 3 или 4 раза в отдельных трубок и объединить решения, когда концентрация ДНК переваривается с помощью Amicon Ультрацентробежная устройств.
2. Инкубировать при 37 ° С в течение 3 часов и тепловой инактивации фермента смесь при температуре 65 ° С в течение 20 минут.
3. В то же время предварительно промыть Amicon Ультра-4 центробежный фильтр устройства с 1 мл Milli-Q вода, спина трубки при 4000 мкг в течение 6-8 минут и отказаться проходить через.
   Примечание: не позволяйте мембраны высохнуть раз мокрой. Если вы не используете устройство после предварительной промывки, из воды на мембране, пока устройство не используется.
4. Передача тепла инактивированной решение, начиная с шага 2, чтобы предварительно промыть Amicon центробежный фильтр отрядов, спина трубки при 4000 мкг в течение 6-8 минут и отказаться проходить через.
   Обратите внимание: если вы подготовили более одного линеаризации смешивать, сочетать все решения в одном Amicon центробежный фильтр отрядов.
5. Центрифуга, пока количество раствора на Amicon фильтра уменьшается до примерно 100 ~ 150 м ищ л Добавить еще 1,5 мл стерильной воды в пустую трубку сверху и передачи решения Amicon трубку и повторите шаг центрифугирования. Вымойте второй раз с 1,5 мл стерильной воды и отказаться проходить через раз. Сокращение конечного объема в ~ 150 мкл. Промывки удалите остатки соли из буфера для предотвращения выгибая когда пульсирующие клетки.
   Обратите внимание: мы используем Бакет ротор для центрифугирования шаг, просто место ограничено Amicon центробежного фильтра в трубке 50 мл Сокол чтобы удерживать его на месте во время центрифугирования. Amicon фильтр устройства сохраняют 50 мкл раствора на фильтр, даже после длительного центрифугирования.
6. Для дальнейшей концентрации препарата ДНК передачи оставшийся раствор ДНК из Amicon фильтрующее устройство, чтобы предварительно промыть микроконтроллер YM-30 центробежный фильтр группы и промыть Amicon трубы с дополнительными 50 мкл стерильной воды, чтобы восстановить все ДНК. Центрифуга микроконтроллер центробежный фильтр группы в микроцентрифужных на 10000 мкг до фильтра еще чуть-чуть покрыты жидкостью. Только спина на короткое время и проверять каждую минуту, если только небольшим количеством жидкости остается на фильтре. Чтобы восстановить ДНК решение, место фильтром вниз головой в новую пробирку микроцентрифужных и спина на втором этапе центрифугированием при 1000 мкг в течение 3 минут. Конечный объем не должен превышать 10-15 мкл в общей сложности, в противном случае ваша ДНК может быть слишком разбавленным для преобразования шагом.
   Обратите внимание: не спин фильтрующее устройство слишком долго, и пусть не полностью высохнуть, чтобы предотвратить возможную потерю образца. Если ваша оболочка сухая, добавьте 10-15 мкл стерильной воды на мембране, агитировать мягко в течение 30 секунд и восстановления ДНК, как описано выше.

Часть 3: Преобразование в P. pastoris электропорацией

1. Линеаризованной и концентрированных pPICZαA ДНК, содержащий ваши вставить готов к превращению в electrocompetent П. pastoris клеток (см. шаг я, часть 2). Около 15 минут до преобразования подготовить следующие реагенты и приборы: заполнить микроцентрифужную пробирку с 1 мл 1 М сорбит и поместить его на льду, место 0,2 см электропорации кюветы на льду; этикетке стерильные 15 мл стеклянную трубку и стерильные стеклянные пипетки Пастера под рукой.
2. Передача 80 мкл клеток с шага I, часть 2,7 до ледяной 0,2 см кювете электропорации. Добавить сосредоточены линеаризованной pPICZαA раствора ДНК с шагом I, части 3,6 и перемешать, перемещая пипетки из стороны в сторону в электропорации кюветы.
   Примечание: при добавлении ДНК только нажать пипеткой первая остановка. После смешивания с ДНК клетки толчок пипетки до второй остановки и медленно удалить из кювета.
3. Инкубируйте кювету с клетки на льду в течение 5 минут.
4. Протрите наружную поверхность кюветы с тканью и пульс клеток в соответствии с параметрами для дрожжей (Saccharomyces CEREVISIAE) как это было предложено производителем конкретного устройства электропорации используется.
   Обратите внимание: мы используем Bio-Rad GenePulser со следующими условиями:
   • Зарядное напряжение (V): 1500;
   • Емкость (мкФ): 25;
   • Сопротивление (Ω): 200.
   Использование 0,2 см электропорации кюветы, протокол генерирует длительность импульса ~ 10 мс при напряженности поля ~ 7500 В / см.
5. Сразу же добавить 1 мл ледяной 1 М сорбита в кювете. Передача содержания кювете на 15 мл стерильной трубки использованием стерильной стеклянной пипетки Пастера.
6. Пусть труба инкубировать при температуре 30 ° С без встряхивания в течение 1,5 часов.
7. Добавить 5-7 стерилизованные стеклянные бусы на четырех помечены YPDS пластины, содержащей 100 мкг / мл Zeocin. Спред 250 мкл электропорации смесь из 15 мл стеклянной трубки на каждой пластине. Встряхните пластину горизонтально чтобы равномерно распространено клеток. Пусть пластинка высохнуть в течение 15 минут, а затем удалить бусы из агар опрокидыванием планшета.
   Обратите внимание: мы используем 100 мкг / мл Zeocin выбрать для трансформантов при использовании GS115 Pichia напряжения. Выбор условия могут отличаться, если вы используете другой Pichia напряжения.
8. Инкубируйте пластины с ног на голову в течение 2 до 3 дней при температуре 30 ° С до образовывать колонии. Оберните пластин в черный пластик, чтобы предотвратить деградацию светочувствительных Zeocin. За вычетом суммы антибиотика в пластинах может привести к ложным положительным клонов.
9. После колонии образовали, выбрать 12 колоний и очистить их полос клонов на свежем YPDS пластины, содержащей 100 мкг / мл Zeocin.

Шаг II: Белок выражение в Pichia pastoris

На этом этапе вам необходимо иметь следующие средства массовой информации, тарелки и реактивы под рукой:

• BMGY среда
• глицерина, стерилизованные
• BMMY среда
• метанол, стерилизованные
• ЭПИЦЕНТР Дрожжи очистки ДНК комплект

ВыТакже необходимы следующие колбы:

• 250 мл колбу, автоклавного
• 1 л тупик колбу, автоклавного
• 200 мл стакан, автоклавного

Часть 1: Белки выражение в Pichia pastoris

Все следующие шаги, также выполняются для преобразованного вектора управления (без вставки).

1. Выберите одну колонию из очищенного Pichia колоний, начиная с шага I, части 3,9 и привить в 25 мл BMGY в стерильной колбе 250 мл. Рост при 30 ° С в пожимая инкубатор (250-300 оборотов в минуту), пока культура достигает OD ₆₀₀ = 2-6 (примерно 16-18 часов).
   Примечание: разбавить ваш образец перед измерением на спектрофотометре, чтобы получить точный результат. Клетки будут в лог-фазе роста.
2. Когда клетки достигли соответствующие OD ₆₀₀ подготовиться глицерина акций. Передача 800 мкл 25 мл клеточной культуры для 2 мл Corning cyrogenic флакона и добавляют 200 мкл стерилизованной глицерина. Замораживание фондовом глицерин и хранят при температуре -80 ° C.
3. Для очистки ДНК дрожжей, передача 1,5 мл 25 мл клеточной культуры для микроцентрифужных трубки. Урожай клетки центрифугированием при 1300 мкг в течение 1 минуты при комнатной температуре. Эти клетки используются для анализа Pichia integrants, чтобы проверить дважды, если ген интерес интегрированы в Pichia генома (см. шаг II, часть 2). Магазин осадок клеток при 4 ° С до дальнейшего анализа.
4. Передача остальных 25 мл культуры 50 мл трубки Сокол и урожай клетки центрифугированием при 3000 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре. Декантировать супернатант и место трубы вверх дном на салфетку, чтобы удалить остатки средств массовой информации. Для мытья осадок клеток ресуспендируют его в 20 мл BMMY для удаления оставшихся среду BMGY, как глицерин из BMGY среды может подавлять позднее выражение. Центрифуга снова в 3000 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре и переливать супернатант.
5. Ресуспендируют осадок клеток для OD ₆₀₀ из 1.0 в BMMY средних индуцируют экспрессию (примерно 100-200 мл) и передачи культуры в 1 литре тупик колбу. Обложка колбу с 200 мл стакан и вернуться в инкубатор для продолжения роста при 30 ° С.
   Примечание: важно, чтобы температура не превышала 30 ° C. Если температура колеблется в вашем инкубаторе установить температуру на 28 ° C. Адекватная аэрация также является важным параметром для эффективного выражения во время метанол индукции (при вызывающие выражения, никогда не превышала объем культуры> 10-30% от общего объема колбы). Мы настоятельно рекомендуем использовать тупик колбы, как они вводят больше кислорода в культуральной среде.
6. Добавить стерилизовать чистого метанола в конечной концентрации 0,5% метанола каждые 24 часа для поддержания индукции.
7. В определенные моменты времени после начала передачи выражения 1 мл культуры с 1,5 трубки микроцентрифужных мл. Центрифуга при 1300 мкг в течение 2,5 минут при комнатной температуре. Передача супернатант в отдельную трубку микроцентрифужных 1,5 мл. Магазин супернатант и клеточные гранулы при температуре -80 ° C до дальнейшего анализа. Образцов из различных моментов времени будут проанализированы, чтобы установить оптимальный период времени для экспрессии белка после индукции.
   Примечание: мы выбираем 6h, 12h, 24h, 36h и 48 часов, как временные точки для принятия образцов. Дальнейший рост за 4 суток возможно. Оптимальные моменты времени изменяются между различными выразил белков.
8. Анализ супернатантов и клеточные гранулы для экспрессии белка по Кумасси окрашенных SDS-PAGE и Вестерн-блот (не описанных в данном протоколе).

Часть 2: Дрожжи очистки ДНК и ПЦР-анализ Pichia неотъемлемой

Все реагенты, необходимые для очистки ДНК дрожжей шаг Pichia культуры в BMGY включены в ДНК дрожжей MasterPure Очистка Kit от ЭПИЦЕНТР.
Примечание: данный анализ является дополнительным и проводится, чтобы определить, ген интерес интегрированы в Pichia генома. Осадок клеток из 1,5 мл пробы из культуры в BMGY (см. шаг II, часть 1.3) используется.

Следуйте инструкциям Дрожжи Эпицентр MasterPure ручной очистки ДНК и запустить ПЦР с ДНК дрожжей с праймерами, специфичными для вставки. Анализ 3 мкл вашего продукта ПЦР на агарозном геле, содержащем 1 мкл бромистого этидия. Включите 1 Кб ⁺ размер маркера в одной скважине для интерпретации размер вашей вставки и визуализировать ДНК с использованием геля станции документации.

Рекомбинантного белка могут быть проанализированы с помощью анализа блот западной. Белки очистки может быть выполнена очистка Его-теги на металлические заряженные смолы (не описанных в данном протоколе).

Приложение, список рецептов

Шаг I:

1. YPD среды:
   Для подготовки 600 млиз YPD среды (Дрожжевой экстракт Пептон Декстроза Medium) растворяют 5 г экстракта дрожжей и 12 г пептона в 540 мл воды. Автоклав в течение 20 минут на жидком цикла.
   В то же время подготовить 70 мл 20% глюкозы и фильтр-стерилизовать перед использованием.
   Пусть автоклавного решение круто ~ 60 ° C и добавить 60 мл фильтр-стерилизовать 20% декстрозы.
2. YPDS (+ Zeocin) плиты:
   Для подготовки 500 мл YPDS + Zeocin агар (Дрожжевой экстракт Пептон Декстроза среде с сорбит) растворяют 5 г дрожжевого экстракта, 91,1 г сорбита и 10 г пептона в 450 мл воды. Добавьте 10 г агара и магнитной мешалкой и автоклаве в течение 20 минут на жидком цикла.
   В то же время подготовить 60 мл 20% глюкозы и фильтр-стерилизовать перед использованием.
   Пусть автоклавного решение круто ~ 60 ° C, добавить 50 мл фильтр-стерилизовать 20% декстрозы.
   Вылейте несколько пластин перед добавлением антибиотиков для YPDS пластины без Zeocin. Затем добавьте 500 мкл Zeocin от 100 мг / мл исходного раствора для получения конечной концентрации 100 мкг / мл Zeocin в агар. Давайте перемешать на магнитной пластине при добавлении антибиотиков и пусть движение в течение примерно еще 2 минуты, чтобы в равной степени перемешать.
   Налейте СМИ в чашки Петри и накрыть черного пластика. Давайте пластин сушить на скамейке в одночасье. Магазин YPD чашки, содержащие Zeocin при 4 ° C. Срок хранения является одной до двух недель.
   Примечание: покрытие с пластиковыми необходимо потому, что Zeocin является светочувствительным.

Шаг II:

1. BMGY (буферизацией Глицерин-комплекс Medium) и BMMY (буферизацией Метанол-комплекс Medium):
   Растворите для каждой среды 8 г экстракта дрожжей и 16 г пептона в 560 мл воды. Автоклав в течение 20 минут на жидком цикла.
   В то же время подготовить следующие решения:
   • 1 М калий фосфатный буфер, рН 6.0:
   Комбинат 24 мл 1 М K ₂ HPO ₄ и 156 мл 1 М K ₂ HPO ₄ и подтвердить, что рН = 6.0 (при рН должна быть скорректирована, используйте фосфорная кислота или КОН). Фильтр стерилизуют и хранят при комнатной температуре. Срок годности этого решения больше, чем один год.
   • 10X YNB (13,4% Дрожжи азотистого основания сульфатом аммония без аминокислот):
   Растворите 26,8 г дрожжей базы азота (YNB) с сульфатом аммония и без аминокислот в 200 мл воды и фильтруют стерилизовать. Тепло решение о роспуске YNB полностью в воде. Хранить при температуре 4 ° С. Срок хранения этого раствора составляет примерно один год. Примечание: Также можно использовать 3,4 г YNB без сульфата аммония и без аминокислот и добавить 10 г сульфата аммония.
   • 500X B (0,02% Биотин):
   Растворите 10 мг биотина в 50 мл воды и фильтруют стерилизовать. Хранить при температуре 4 ° С. Срок хранения этого раствора составляет примерно один год.
   • 10X M (5% метанола):
   Смешайте 5 мл метанола с 95 мл воды. Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° C. Срок хранения этого раствора составляет около двух месяцев.
   • 10X GY (10% глицерина):
   Смешайте 10 мл глицерина с 90 мл воды. Фильтры стерилизовать. Хранить при комнатной температуре. Срок годности этого решения больше, чем один год.
   Пусть автоклавного решение остыть до комнатной температуры, затем добавить следующее и хорошо перемешайте:
   • 80 мл 1 М калий фосфатный буфер, рН 6,0;
   • 80 мл 10X YNB
   • 0,16 мл 500X B
   • 80 мл 10X GY
   Для приготовления BMMY, добавить 80 мл 10X M вместо глицерина.
   Магазин средств массовой информации при 4 ° C. Срок хранения этого раствора составляет около двух месяцев.

Представитель Результаты

Рисунок 1. Этот западный образ пятном показаны четыре выразил белков (маркированы как 1605, 0537, 1228 и 1682) после 24 часов выражения. Антитела используются для иммуноблоттинга было с-Myc-HRP антител. Вторая полоса (обозначенный N) имеет отрицательный контроль и был загружен супернатант из клеток, которые не выражают рекомбинантного белка, потому что они были преобразованы с родителем (обычная) вектор.

Обсуждение

Белки выражения с помощью метилотрофных дрожжей Pichia pastoris качестве хост-системы, описанной в этой протокола. Белок может быть секретируется в среду в зависимости от используемого клонирования вектор. Выделение рекомбинантного белка делает последующей очисткой легче. Тем не менее, показали условия, возможно, придется быть оптимизирован для экспрессии различных белков и изменения в условия и выражения раза может привести к повышению уровня белка. Вектор, используемый в данном протоколе имеет особенность