Препарирование Организатор и эксплантов животных Полюс от Xenopus laevis Эмбрионы и Ассамблеи Пробирной клеточной адгезии

Краткое содержание

Это видео демонстрирует технику используют для приготовления организатором и эксплантов животных полюса от эмбрионов Xenopus laevis, в том числе использование бровь ножом - специализированный инструмент, рассечение из одного в бровь. Протокол для сборки сцепления анализа уделяется также, что зонды на наличие ключевых молекул адгезии присутствуют на поверхности организатором или животного полюса клетки, которые имеют решающее значение для правильного развития.

Протокол

Подготовка Адгезия палат (за день до инъекции / рассечение)

Адгезия Пробирной палаты

Если у вас есть обычный микроскоп соединения (оптического находит над сценой), он ncecessary сделать малоэтажного адгезии камеру следующим образом. При использовании перевернутой оптикой микроскопа, то "Nunc Lab-Tek патрон покровного стекла" может просто быть использован, и пропустить шаги # 1 - 2.

1. Прикрепите один из "пресс-к-уплотнение кремния изолятор» на 40 х 24 мм покровным стеклом. Плотно прижмите изолятора покровным стеклом на чистой настольные и посмотреть с другой стороны, чтобы убедиться, что изолятор полностью прилагается без каких-либо воздушных пузырьков.
   
   
2. Дополнительно: Положите адгезии камер в стеклянном блюде Петри с Whatman фильтровальной бумаги и автоклава в сухом цикла стерилизации. Прохладный их к РТ.

Покрытие палаты

1. Положить 200 мл капли рабочего раствора кадгерина (10mg/ml) или фибронектина (20mg/ml) на центр автоклавного камеры адгезии, используя sigmacoated желтый советы. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 4 часов.
   
   
2. Выньте кадгерина или фибронектина решение и трансфер в 1,5 мл трубки. Это решение может быть использовано для следующих двух недель.
   
   
3. Разлить 500 мл 4% BSA в 1x MBS-H для блокирования камеры. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа.
   
   
4. Аспирируйте решение BSA. Вымойте камеру с 500 мл 1x MBS-H в два раза. После второго мытья, аспирация большинство MBS-H (не полностью), и хранить в плотно закрытой таре при температуре 4 º С. Это сцепление камеры, что хорошо для следующих 2 - 3 дня.

Разбор и диссоциации эксплантов животных Cap

1. Инкубируйте вводят эмбрионов в 0.1x MBS-H, разбавленный из автоклавного 1x MBS-H, а неавтоклавного среды когда-то несет мало микробов, которые могут нарушить диссоциированных клетки шапка животного.
   
   
2. Сделать 1x Барта агарозном пластин и CMF-MBS агарозном пластин с 60мм блюда, по крайней мере больше, чем количество ваших образцов. Налейте автоклавного 1x MBS-H для пластин 1x Барта. Для CMF-MBS тарелки, залить 10 мл CMF-MBS.
   
   
3. Когда эмбрионы стать этапе 8.5, начала вскрытия животных шапки в пластине 1x Барта. 10 - 15 эксплантов на образцы, как правило, достаточно для эксперимента.
   
   
4. Передача эксплантов животных шапку CMF-MBS пластины. Инкубируйте эксплантатов в течение 45 - 60 минут, пока эксплантов полностью диссоциирован. Нежный волнений в каждые 15 минут поможет диссоциации.

Анализ клеточной адгезии

1. Посев клеток: Внесите 500 мл 1x MBS-H для адгезии камеры подготовлен в действия, описанные в предыдущих разделах, Палаты адгезии покрытия и Пробирной палаты. Передача диссоциированных клетки шапка животное от CMF-MBS пластины сцепления камеру P200 с использованием sigmacoated и отрубленными желтый советы.
   
   
2. Дополнительно: Если это возможно, тщательно подлизываться среде до примерно 2 / 3 до половины, не подвергая клетки воздуха. Добавьте примерно такое же количество свежего MBS-H, чтобы убедиться, что среда содержит достаточное Са ^{2 +} и Mg ^{2 +.}
   
   
3. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 45 - 90 минут. Проверьте клетки иногда, чтобы убедиться в их крепления на нижней поверхности.
   
   
4. Теперь вы можете взять картину клетки под микроскопом.
   
   
5. Положите сцепление камеры на стекле сетки. Совместите один из углов камеры адгезию к углу сетки слайда. Граф и записи количества прилагается клетки в нескольких различных сетей.
   
   
6. Залить 1 л MBS-H в большое ведро пластика (например, Tupperware, и т.д.). Аккуратно положил камеру адгезии слайд на дно ведра. Поверните его на орбитальном шейкере в течение пяти минут на малой скорости (50 - 60rpm).
   
   
7. Положите адгезии камеру обратно на сетку слайда, выравнивая же углу камеры к тому же углу сетки слайдов, как это было сделано на шаге № 5 настоящей статьи, Пробирной клеточной адгезии. Подсчитайте количество клеток, которые остаются прикрепленными на той же сетке, что вы насчитали до мытья. Рассчитать процент клеток, которые остаются прикрепленными после стирки.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1x MBS-H	Буфер			Модифицированная среда Барта (Barth’s medium); рецепт на 1 L: 5.14 g NaCl, 5 mg KCl, 0.2 g NaHCO3, 0.2 g MgSO4•7H2O, 60 mg CaCl2•2H2O, 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2, 38 g HEPES (в форме свободной кислоты). Доведите pH до 7.4 с помощью NaOH. Стерилизовать в автоклаве.
CMF-MBS	Буфер			Это версия MBS-H, не содержащая Ca2+/Mg2+. Рецепт на 500 mL: 2.57 g NaCl, 37.5 mg KCl, 0.1 g NaHCO3/sub>, 1.19 g HEPES (в форме свободной кислоты). Доведите pH до 7.4 с помощью NaOH. Стерилизовать в автоклаве.
Чашки с 1% агарозой/1x средой Барта (Barth’s)				количество соответствует числу образцов
Чашки с 1% агарозой/CMF-MBS				количество соответствует числу образцов
Химера E-кадгерин/Fc	Реагент	Sigma-Aldrich	E-2278	Растворите 0.1 mg сухого E-кадгерина в 100 µL 1x MBS-H, содержащего 40% глицерина, для приготовления 100-кратного основного стока (1.0 mg/mL). Хранить при –20 °C. Непосредственно перед использованием приготовьте рабочий раствор с концентрацией 10 µg/mL путем разведения 1x MBS-H в 100 раз. Для каждого образца потребуется 200 µL данного рабочего раствора.
Фибронектин, 0.1% раствор	Реагент	Sigma-Aldrich	F-1141	Данный готовый раствор можно использовать в качестве 50-кратного стока. Непосредственно перед использованием приготовьте рабочий раствор с концентрацией 20 μg/mL путем разведения 1x MBS-H в 50 раз. Для каждого образца потребуется 200 μL данного рабочего раствора. НЕ рекомендуется использовать сухой фибронектин, так как его трудно растворить при концентрации 0.1% для приготовления сток-раствора. Несмотря на более высокую стоимость, использование готового 0.1% раствора предпочтительнее для получения стабильных результатов.
4% BSA /MBS-H	Буфер			BSA: фракция V, степень чистоты для молекулярной биологии
Желтые наконечники Sigmacoted	Инструмент
Покрывные стекла №1				40 mm x 24 mm или 60 mm x 24 mm
Силиконовый изолятор с герметизацией при нажатии	Инструмент	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	глубина 2.5 mm x диаметр 20 mm
Камерные покровные стекла NUNC Lab-Tek	Инструмент	Fisher Scientific	12-565-471	2 лунки/слайд
Стекло с сеткой	Инструмент			или предметное стекло с окуляр-сеткой для подсчета клеток