Мы демонстрируем протокол для получения химерных эмбрионов данио для живого изображения сотовой поведение во время эмбриогенеза.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Трансплантация GFP-экспрессирующих бластомеров для живых изображений сетчатки и мозга развития в химерические эмбрионов данио рерио
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Клетки изменения широко в местах их расположения и имущества во время эмбриогенеза. Эти изменения регулируется взаимодействие между клетками и окружающей их среды. Химерные эмбрионы, которые состоят из клеток разных генетический фон, большие средства для изучения межклеточных взаимодействий посредничестве генов, представляющих интерес. Эмбриональных прозрачности данио на ранних стадиях развития позволяет прямой визуализации морфогенез тканей и органов на клеточном уровне. Здесь мы демонстрируем протокол для получения химерных сетчатку и мозг в данио эмбрионов и выступать с концертами изображений донорских клеток. Протокол охватывает подготовку трансплантации иглы, трансплантации GFP-экспрессирующих доноров бластомеров на GFP-отрицательный Саваоф, и изучение клетки-донора поведения в живых конфокальной микроскопии. С небольшими изменениями, этот протокол также может быть использован для изучения эмбрионального развития других тканей и органов в данио. Преимущества использования GFP в клетки донора этикетке также обсуждаются.
Протокол
День 1. Подготовка
1. Настройка рыбы кресты
Настройка попарно кресты данио в вечернее время. Для предотвращения случайного скрещивания до нужного времени, используйте циркуль, чтобы отдельные женские и мужские рыбы в брачный кассет. GFP-экспрессирующих трансгенных рыб используются в качестве источника донорских бластомеров. Pt104 трансгенные линии (Цзоу и соавт., 2008), используемый здесь, выражает GFP повсеместно под контролем EF1 промоутера. GFP выражение позволяет визуализировать донорских клеток живыми изображениями. Другие трансгенных линий рыбы, которые выражают подходящий флуоресцентные белки могут ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом видео мы продемонстрируем метод трансплантации бластомеров проанализировать сетчатки и развитие мозга в данио. Этот протокол также может быть использована для анализа развития других тканей и органов просто выпуская доноров бластомеров в соответствующих местах в принимающей эмбрионов. Маркировки с GFP молекул дает более чистый фон, чем маркировка с флуоресцентным красителем-сопряженных декстрана (Ho и Kane, 1990). Это потому, что мусор красителей Декстран от мертвых клеток донора длится намного дольше, чем GFP, т.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Это исследование было поддержано Национальным институтом здоровья (NIH) Core Грант (5P30EY008098) и следующие средства для XW: NIH Грант R01EY016099 и исследований в области профилактики слепоты развития карьеры Award. Мы благодарим Кира Латроп за помощь в конфокальной микроскопии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
E3 яйцо воды:
- 5 мМ NaCl
- 0,17 мМ KCl
- 0,33 мМ CaCl 2
- 0,33 мМ MgSO 4
- 0,1% метиленовым синим
Ссылки
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). TH....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
