Методическая статья

Генерация сфероидов из клеточных линий: трехмерный (3D) метод культивирования клеток

30 апреля 2023 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Dillard, P., et al. Анализ убийства сфероидов с помощью CAR-Т-клеток. J. Vis. Exp. (2018).

Сфероиды - это тип 3D-модели клеточной культуры, используемый для более точного представления клеточной среды по сравнению с 2D-моделями монослоев клеточных культур. В примере протокола мы увидим, как ученые генерируют сфероиды из клеточной линии колоректального рака и применяют визуализацию живых клеток для отслеживания роста сфероидов.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Генерация сфероидов из клеточной линии колоректального рака

  1. Промойте HCT 116 (стабильно препрецируемый для экспрессии кластера дифференцировки 19 (CD19) и зеленого флуоресцентного белка (GFP)) монослоями клеток фосфатным солевым буфером (PBS; 5 мл для 25 см2 или 10 мл для колбы 75 см2). Добавьте трипсин (0,5 мл для колбы 25 см2 или 1 мл для колбы 75 см2) и инкубируйте клетки при 37 °С в течение 5 мин.
  2. Проверьте отслойку клеток под микроскопом и нейтрализуйте фермент диссоциации клеток полной средой Roswell Park Memorial Institute 160 (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + гентамицин; 10 мл для колбы 2 см 2 см или 20 мл для колбы 75 см2).
  3. Центрифугируйте клеточную суспензию при давлении 500 x g в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и повторно суспендируйте ее несколькими дозами 5 мл полной среды RPM1 1640
    4. .
  4. Подсчитайте ячейки с помощью исключения Trypan blue на совместимом счетчике ячеек.
  5. Центрифужную суспензию клеток при 500 х г в течение 5 мин. Удалить надосадочную жидкость с помощью пипетки и повторно суспендировать в среде RPMI до получения 5 х 103клеток/мл.
  6. Покройте 96-луночный круглый нижний планшет 100 мкл/лунка 100 мкг/мл поли-L-лизина (ФАПЧ) в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Дважды вымойте PBS и дайте тарелке высохнуть.
  7. Перенесите клеточную суспензию в стерильный резервуар и диспонируйте 200 μл/лунку в 96-луночные круглые донные планшеты с покрытием PLL с помощью многоканальной пипетки.
  8. Перенесите планшет в автоматизированный аппарат визуализации внутри инкубатора (37 °C, 5%CO2, 95% влажности).
  9. Войдите в программное обеспечение для сбора данных, выберите «Запланировать захват» | «Спустить на воду», «Добавить судно» | «Сканировать по расписанию» | «Создать судно: новое».
  10. Выберите тип сканирования: Сфероид. Выберите интересующие каналы: Phase + Brightfield (для отслеживания роста сфероидов), Green (для отслеживания опухолевого сигнала, время регистрации 300 мс) и Red (для отслеживания апоптоза, время регистрации 400 мс).
    1. Выберите желаемое увеличение: 10x.
    2. Выберите модель тарелки и ее положение в ящике. Выберите положение скважин на изображении. Введите описание эксперимента: название, тип клеток, количество ячеек.
  11. Для настройки анализа выберите Отложить анализ на потом. Щелкните правой кнопкой мыши на временной шкале и выберите опцию Установить интервал выбранной группы сканирования, а также установите Добавлять сканирования каждые до 4 часов и В общей сложности до 24 часов. Установите желаемое время запуска (не менее 1 ч после инкубации в автоматизированном аппарате визуализации).
  12. Проверяйте каждые 2 дня на рост сфероидов, войдя в программное обеспечение для визуализации.
    1. Выберите опцию «Просмотреть последние сканирования» и дважды щелкните нужный эксперимент. Выберите «Светлое поле» на панели каналов изображения, а затем используйте инструмент «Измерить особенности изображения» для измерения диаметра сфероидов. Сфероиду требуется 6 дней, чтобы достичь нужного размера: 0,5 мм в диаметре. Добавьте 50 мкл полной среды RPMI на лунку на 4-й день, чтобы ограничить эффект испарения среды.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фосфатный буферный раствор ДульбеккоSIGMA-ALDRICHD8537-500MLНомер лота: RNBG7037
75 см² площадь роста колбВВР430639Номер лота: 2218002
75 см² площадь роста колбВВР734-2705Номер лота: 3718006
Trypsin-EDTASIGM-ОЛДРИЧТ3924-100млНомер лота: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 млТехнологии Life (Gibco)No 21875-091Номер лота: 1926384
ГентамицинТермо Фишер15750060Номер лота: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%Термо Фишер15250061Номер лота: 1886513
96 луночная пластина, круглое дноВВР734-1797Номер лота: 33117036
X-VIVO 15 с гентамицином L-Gln, Phenol Red, 1 лБиоНордикаБЭ02-060КНомер лота: 8MB036
Резервуар для реагентовВВР89094-672Номер лота: 89094-672
15 мл тубыВВР734-1867Номер лота: 19317044
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаGibco10500064Номер лота: 08Q3066K
HCT 116 Линия колоректальной карциномыАТКСССЛ-247- T
Incucyte S3Эссен Бионаука
гг. гг.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи