Генерация сфероидов из клеточных линий: трехмерный (3D) метод культивирования клеток

1. Генерация сфероидов из клеточной линии колоректального рака

1. Промойте HCT 116 (стабильно препрецируемый для экспрессии кластера дифференцировки 19 (CD19) и зеленого флуоресцентного белка (GFP)) монослоями клеток фосфатным солевым буфером (PBS; 5 мл для 25 см² или 10 мл для колбы 75 см²). Добавьте трипсин (0,5 мл для колбы 25 см² или 1 мл для колбы 75 см²) и инкубируйте клетки при 37 °С в течение 5 мин.
2. Проверьте отслойку клеток под микроскопом и нейтрализуйте фермент диссоциации клеток полной средой Roswell Park Memorial Institute 160 (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + гентамицин; 10 мл для колбы 2 см 2 см или 20 мл для колбы 75 см²).
3. Центрифугируйте клеточную суспензию при давлении 500 x g в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и повторно суспендируйте ее несколькими дозами 5 мл полной среды RPM1 1640
.
4. Подсчитайте ячейки с помощью исключения Trypan blue на совместимом счетчике ячеек.
5. Центрифужную суспензию клеток при 500 х г в течение 5 мин. Удалить надосадочную жидкость с помощью пипетки и повторно суспендировать в среде RPMI до получения 5 х 10³клеток/мл.
6. Покройте 96-луночный круглый нижний планшет 100 мкл/лунка 100 мкг/мл поли-L-лизина (ФАПЧ) в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Дважды вымойте PBS и дайте тарелке высохнуть.
7. Перенесите клеточную суспензию в стерильный резервуар и диспонируйте 200 μл/лунку в 96-луночные круглые донные планшеты с покрытием PLL с помощью многоканальной пипетки.
8. Перенесите планшет в автоматизированный аппарат визуализации внутри инкубатора (37 °C, 5%_CO2, 95% влажности).
9. Войдите в программное обеспечение для сбора данных, выберите «Запланировать захват» | «Спустить на воду», «Добавить судно» | «Сканировать по расписанию» | «Создать судно: новое».
10. Выберите тип сканирования: Сфероид. Выберите интересующие каналы: Phase + Brightfield (для отслеживания роста сфероидов), Green (для отслеживания опухолевого сигнала, время регистрации 300 мс) и Red (для отслеживания апоптоза, время регистрации 400 мс).
    1. Выберите желаемое увеличение: 10x.
    2. Выберите модель тарелки и ее положение в ящике. Выберите положение скважин на изображении. Введите описание эксперимента: название, тип клеток, количество ячеек.
11. Для настройки анализа выберите Отложить анализ на потом. Щелкните правой кнопкой мыши на временной шкале и выберите опцию Установить интервал выбранной группы сканирования, а также установите Добавлять сканирования каждые до 4 часов и В общей сложности до 24 часов. Установите желаемое время запуска (не менее 1 ч после инкубации в автоматизированном аппарате визуализации).
12. Проверяйте каждые 2 дня на рост сфероидов, войдя в программное обеспечение для визуализации.
    1. Выберите опцию «Просмотреть последние сканирования» и дважды щелкните нужный эксперимент. Выберите «Светлое поле» на панели каналов изображения, а затем используйте инструмент «Измерить особенности изображения» для измерения диаметра сфероидов. Сфероиду требуется 6 дней, чтобы достичь нужного размера: 0,5 мм в диаметре. Добавьте 50 мкл полной среды RPMI на лунку на 4-й день, чтобы ограничить эффект испарения среды.