Этот протокол является выдержкой из Zhao et al, In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish, J. Vis. Exp.(2019).
Все эксперименты в этом исследовании проводились в соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения США по уходу и использованию лабораторных животных. Все протоколы для животных в этом исследовании были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в учреждениях Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе.
1. Индукция анестезии
- Подготовьте иммерсионную анестезию для контроля боли и иммобилизации рыб, чтобы избежать артефактов движения во время сбора данных ЭКГ. В большинстве лабораторий используется иммерсионный трикаин (этил3-аминобензоат метансульфонат, MS-222).
- Чтобы приготовить 0,4% исходный раствор трикаина, смешайте в бутылке из темного стекла с завинчивающейся крышкой: 400 мг порошка трикаина, 98 мл воды двойной дистилляции и 2 мл 1 М Триса (pH 9). Отрегулируйте pH до 7,0 с помощью 1 Н NaOH или 1 Н HCl по мере необходимости.
- Чтобы приготовить окончательное раствор для погружения в трикаин, определите минимальную концентрацию, подходящую для возраста, размера, метаболического состояния, штамма, модели заболевания, научных целей и продолжительности процедуры.
- Проведите исследование концентрации трикаина и реакции, повышая или уменьшая рекомендуемую концентрацию 168 мг/л (или 0,0168%)9, если это необходимо, чтобы достичь уровня анестезии 4 в течение 3 минут с минимально возможной кардиореспираторной токсичностью. Например, в данном исследовании погружение рыбок дикого типа AB в возрасте 12-18 месяцев в 0,02-0,04% раствор трикаина вызовет 4-й уровень анестезии в течение 3 мин.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: На 4 уровне анестезии полностью теряется равновесие и мышечный тонус, снижается скорость оперкулярного движения.
- При необходимости проконсультируйтесь с ветеринарным врачом в Комитете по уходу за животными и их использованию (IACUC) для получения дополнительных рекомендаций о целесообразности выбора анестетика (анестетиков) и способа его введения.
- Погрузите взрослого рыбку данио в чашку, содержащую раствор трикаина в самой низкой заранее определенной и одобренной IACUC концентрации (например, 0,02-0,04% в этом исследовании), чтобы вызвать уровень анестезии 4 в течение 3 минут (Рисунок 1).
- Для протокола ЭКГ для выживания сеанс записи ЭКГ должен быть как можно короче (менее 10 минут). Для кратковременных сеансов записи ЭКГ продолжительностью менее 15 минут поддержание анестезии не требуется.
- Для длительных сеансов записи ЭКГ продолжительностью несколько часов используйте внутримышечное паралитическое средство длительного действия и систему перфузии для обеспечения достаточной гидратации и насыщения кислородом.
2. Установка отведений ЭКГ
- После того, как рыбка данио будет поддерживать уровень анестезии 4 в течение 3 с, с помощью пары тупых щипцов немедленно перенесите рыбу на влажную прорезь губки так, чтобы ее вентральная поверхность была самой верхней для размещения электродов ЭКГ (Рисунок 2).
- Осторожно вставьте три электрода в электроды ЭКГ в мускулатуру рыбы на глубину примерно 1 мм, чтобы создать биполярный отведение во фронтальной плоскости, параллельной лево-правой краниальной ориентации главной оси сердца.
- Расположите положительный (красный) электрод в вентральной средней линии на уровне артериальной луковицы, т.е. на 1-2 мм выше воображаемой линии, соединяющей два нижних края оперкулумов (рис. 2А).
- Расположите отрицательный (черный) электрод каудально и на 0,5-1,0 мм влево от положительного электрода, на расстоянии, превышающем максимальную апикобазальную длину желудочка взрослой рыбки данио (рис. 2А).
- Расположите электрод сравнения (зеленый) каудально, рядом с анальной областью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку главная ось сердца несколько варьируется от рыбы к рыбе, чтобы максимизировать амплитуды зубцов R и T, корректируйте положение свинца, внося лишь небольшие, систематические изменения методом проб и ошибок. Например, меняйте один электрод (положительный или отрицательный) вместо обоих электродов за раз и вносите постепенные изменения в одном указанном направлении, прежде чем переключиться на другое, вместо того, чтобы делать беспорядочные изменения в случайных направлениях.
3. Запись ЭКГ
- Откройте программу сбора данных ЭКГ. Выберите нужную настройку из раскрывающихся меню для диапазона, низких частот и высоких частот. Например, следующая настройка в системе регистрации ЭКГ in vivo, используемой в этом эксперименте, дает стабильное, удовлетворительное соотношение сигнал/шум для нормальной взрослой рыбки данио: диапазон «2 мВ», низкие частоты «120 Гц» и верхние частоты «0,03 с».
- Нажмите Start, чтобы начать непрерывную запись ЭКГ без щелей с частотой дискретизации 1 кГц.
- Чтобы оптимизировать положение отведений для максимального соотношения сигнал/шум, нажмите Стоп, чтобы остановить запись ЭКГ и просмотреть траекторию ЭКГ вскоре после самой первой попытки записи для каждого сердца. Чтобы диагностировать, что ЭКГ взрослой рыбки данио в норме, убедитесь, что все следующие четыре валидационных критерия удовлетворены (рис. 3):
- Критерий 1: Убедитесь, что все формы волн ЭКГ (P, QRS И T) четко различимы и хорошо видны.
- Критерий 2: Убедитесь, что зубец P положительный.
- Критерий 3: Убедитесь, что суммарный комплекс QRS положителен (т.е. амплитуда зубца R больше, чем сумма амплитуд зубцов Q и S).
- Критерий 4: Убедитесь, что зубец Т положительный.
- Если ожидается нормальная ЭКГ, при необходимости измените положение электродов (сначала попробуйте отрицательный электрод), пока не будут удовлетворены все четыре критерия валидации.
- Если ожидается нормальный зубец Т, но зубец Т слишком мал, измените положение электродов, чтобы максимизировать амплитуду зубца Т.
- Возобновите запись ЭКГ после оптимизации позиционирования отведений. Сохраните снимки ЭКГ для последующего анализа.
4. Восстановление после анестезии
- По окончании сеанса записи ЭКГ осторожно снимите электроды, не травмируя рыбу. Переложите рыб в свежую, насыщенную кислородом рыбью воду без трикаина.
- Чтобы облегчить восстановление после анестезии, энергично распыляйте воду на жабры с помощью пастеровской пипетки, пока рыба не возобновит регулярное движение жабр или плавание.
- Следите за полным восстановлением рыбы после анестезии (обычно 1-2 минуты), о чем свидетельствует способность рыбы плавать в вертикальном положении в течение как минимум 5 секунд.
