Анализ захвата добычи: метод изучения поведения личинок данио-рерио при захвате добычи

Аннотация

Источник: Muto, A., et al. Абляция нейронной популяции с помощью двухфотонного лазера и ее оценка с помощью визуализации кальция и поведенческой записи у личинок данио-рерио. J. Vis. Exp.(2018)

Это видео описывает анализ захвата добычи. В видеоролике обсуждается метод изучения поведения личинок данио-рерио при захвате добычи после лазерной абляции конкретных нейронов.

Протокол

1. Оценка поведенческих последствий после лазерной абляции

1. Настройте систему записи поведения, которая состоит из стереоскопа, оснащенного видеокамерой. Используйте камеру с подходящим программным обеспечением для получения изображений, коммерческим или изготовленным по индивидуальному заказу (рис. 1A).
2. Оптимизируйте условия освещения, чтобы параметр можно было обнаружить с помощью обработки изображений. Например, используйте кольцевой белый светодиодный свет с распоркой (рис. 1B).
   Примечание: Расстояние от светодиода и его угол наклона влияют на внешний вид образца (т.е. яркий на темном фоне или темный на светлом фоне) и, следовательно, имеют решающее значение для успешной обработки изображения. Определите наилучшую высоту дистанционной рамки (рисунок 1C).
3. Поместите личинку данио-рерио (полученную в результате эксперимента по лазерной абляции, описанного в разделе 1) в камеру для записи поведения (которая была прикреплена к предметному стеклу) со снятой оригинальной верхней крышкой (рисунок 1D).
4. Соберите из стакана 50 взвешенных в воде парамеций с помощью микропипетки и поместите их в камеру записи.
5. Поместите крышку на верхнюю часть записывающей камеры. Перед размещением на поверхности воды записывающей камеры нанесите небольшую каплю воды на защитную крышку, чтобы избежать попадания воздуха в камеру.
   Примечание: На этом этапе некоторое количество воды с парамециями выльется из записывающей камеры. Оставшееся количество парамеций в записывающей камере составит примерно 30-40.
6. Поместите записывающую камеру (содержащую личинку и парамецию) в систему освещения (рисунок 1D).
7. Начните цейтраферную съемку со скоростью 10 кадров в секунду в течение 11 минут (6 600 кадров).
8. (Необязательно) Для каждой личинки, которая была протестирована на поведение, наблюдайте за флуоресценцией участков, подвергнутых лазерной абляции, с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы подтвердить эффективность лазерной абляции (т.е. отсутствие или значительное уменьшение количества флуоресцентных клеток в области, подвергнутой лазерному излучению).
   Примечание: Даже после облучения некоторые флуоресцентные клетки все еще могут наблюдаться из-за более позднего начала экспрессии гена Gal4 в клетках, которые дифференцировались после абляции.
9. После записи поведения личинки, чтобы компенсировать отсутствие однородности на фоне, выполните попиксельное деление каждого кадра на среднее изображение на Фиджи: нажмите «Обработать», «Калькулятор изображений», «Операция: Разделить», «32-битный (плавающий)результат» и «ОК». Чтобы сделать усредненное изображение, нажмите «Изображение», «Стеки», «Z-проект», «Средняя интенсивность» и «OK» (рис. 1E, F).
10. Подсчитайте количество парамеций, оставшихся в камере, нажав «Анализировать», «Проанализировать частицы», установив диапазон площадей, который охватывает все парамеции, установив флажок «Показать:Маски» и нажав «ОК». Опция 'Show:Masks' предоставит извлеченное изображение paramecia (Рисунок 1G) со списком количества частиц (paramecia) в каждом кадре.
11. Нанесите на график количество парамеций, оставшихся в камере записи с течением времени. Поскольку оценки количества парамеций зашумлены, мы рекомендуем выполнить скользящую среднюю по каждой точке в диапазоне 600 кадров (1 минута) на электронной таблице.

Результаты

Рисунок 1. Анализ добычи и репрезентативные данные у личинок данио-рерио, обработанных лазером.(А) Система записи поведения. Стереомикроскоп был оснащен CMOS-камерой. Изображения были получены с помощью специально созданного скрипта. (B) Компоненты системы освещения. Бумага серого цвета, стеклянный диффузор, белый светодиодный кольцевой свет, диффузор, сделанная на заказ распорка (картон...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Камеры для обработки изображений	Био-лаборатории Грейс	Камеры визуализации CoverWell PCIA-2.5	Используется в качестве камеры записи поведения
ORCA-Flash4.0	Хамамацу Фотоника	Модель: C11440-22CU	Научная CMOS-камера
СЗХ7	Олимп		стереоскоп
Кольцевая светодиодная подсветка	СХС	Модель: LDR2-100SW2-LA	Белый светодиод
Прокладка камеры гибридизации Secure-Seal, 8 камер, диаметр 9 мм x глубина 0,8 мм	Молекулярные зонды	Каталог # S-24732	Используется в качестве записывающей камеры при визуализации Ca