$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Анализ реакции, вызванной прикосновением
- Подготовка 2 эмбрионов dpf для анализа сенсорно-вызванного ответа
- Убедитесь, что время суток, в которое проводится тест, совпадает между экспериментами, потому что активность может сильно меняться в течение дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент должен проводиться вслепую, а порядок тестирования должен быть рандомизирован для минимизации экспериментальных артефактов.
- Присвойте сортам рыб номер, который неизвестен индивидууму, проводящему эксперимент. После этого, используя свободно доступные онлайн-инструменты, сгенерируйте случайный список, который диктует порядок тестирования.
- По крайней мере, за час до тестирования дехорионатизируйте эмбрионы, проделав отверстие в хорионе и осторожно раздвинув хорион с помощью тонкого пинцета. Удалите мусор из чашки Петри, прежде чем вернуться в инкубатор с температурой 28 °C.
- Проведение анализа сенсорно-вызванного ответа
- Нагрейте ступень до 28 °C не менее чем за 15 минут до начала испытаний.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этой ступени контролируется температура, и она будет оставаться на уровне 28 °C в течение всего испытания. Температура влияет на активность, поэтому важно поддерживать постоянную температуру. Если нагреваемая ступень недоступна, то следует контролировать температуру воды и проводить все эксперименты при одной и той же температуре.
- Поместите чашку Петри, наполненную эмбриональной средой (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl2, 0,33 мМ MgSO4 в воде) на освещенную сцену и установите высокоскоростную камеру над чашкой Петри.
- Запустите программное обеспечение для записи с видеокамеры (например, Stream Pix 5, описанное здесь) и на вкладке «Рабочее пространство» выберите скорость съемки 1 000 кадров в секунду (1 000 кадров в секунду), чтобы обеспечить запись быстрого плавания рыбы.
- Работая с одним эмбрионом за раз, поместите эмбрион в середину чашки Петри так, чтобы рыбка данио была хорошо видна в поле зрения.
Примечание: Если эмбрион уплывает до начала эксперимента, замените его другим, так как повторное захват и позиционирование эмбриона может привести к его снижению чувствительности к стимулу, а повторные взрывные реакции могут способствовать мышечной слабости в некоторых моделях заболеваний.
- Начните запись, нажав на кнопку «запись», и подайте механосенсорный стимул эмбриону, осторожно коснувшись его тупой иглой на макушке головы.
- Остановите запись после того, как эмбрион выплывет из поля зрения или вернется в состояние покоя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ускорение достигает пика в течение первых 0,2 секунды реакции на побег после механического стимула. Поэтому убедитесь, что по крайней мере в течение первых 0,2 секунды реакции на побег рыба находится в поле зрения. С помощью программного обеспечения Stream Pix 5 данные будут автоматически сохранены в виде .avi видеофайла. Также можно использовать альтернативные программы для захвата видео, такие как Free Video Capture или Softonic, оба из которых находятся в свободном доступе для загрузки.
- Верните эмбрион в новую чашку Петри и выберите другой эмбрион для тестирования. Проведите тестирование минимум на 15 рыбах.