$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Перенос библиотеки малых молекул
Хотя сложный перенос можно автоматизировать с помощью роботизированных методов переноса, мы опишем ручной метод переноса.
- Библиотеки малых молекул обычно поставляются в формате с 96 лунками, при этом каждое соединение хранится в ДМСО в виде запаса размером 10 мМ. Примерно за 60 минут до того, как эмбрионы достигнут стадии, когда соединения должны быть добавлены, разморозьте желаемое количество 96-луночных планшетов, содержащих аликвоты малых молекул (исходная пластина). Обратите внимание на серийный или другой идентификационный номер исходных номеров. Чтобы свести к минимуму конденсацию на пластинах, размораживание может произойти в камере высыхания, содержащей дриерит (W.A. HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH).
- Кратковременно раскрутите планшеты в настольной центрифуге, оснащенной адаптером для многолуночных планшетов.
- Снимите алюминиевую уплотнительную ленту с исходной пластины. С помощью 12-канальной пипетки разбавьте соединения в исходной пластине до концентрации 0,5 мМ (например, если начать с 250 нл аликвот запаса 10 мМ, добавьте 4,75 мкл ДМСО в каждую лунку).
- Когда эмбрионы в 96-луночном планшете (реципиентном планшете) достигнут желаемой стадии, используйте 12-канальную (2-20 мкл) пипетку для переноса 2,5 мкл соединений (0,5 мМ) с исходных планшетов в реципиентные пластины, содержащие эмбрионы.
- Запишите идентификационный номер исходных пластин на пластинах с эмбрионами-реципиентами. Накройте пластины с эмбрионами и соединениями крышками, аккуратно перемешайте пластины, осторожно поворачивая, и поместите их в инкубатор с температурой 28,5°C.
- Накройте каждую исходную пластину, содержащую неиспользованные малые молекулы (0,5 мМ), алюминиевой уплотнительной лентой и поместите в морозильную камеру при температуре -80°C для длительного хранения.
2. Скрининг эффектов малых молекул путем визуального осмотра фенотипов
- Перед проведением скрининга сформулируйте конкретный критерий того, что будет считаться «попаданием».
- В желаемые моменты развития извлеките из инкубатора 96-луночные планшеты, содержащие эмбрионы, обработанные соединением, и исследуйте каждую лунку под стереомикроскопом. Для лучшей визуализации тонких изменений, таких как изменения в структуре кровообращения, можно использовать фазово-контрастный инвертированный микроскоп. Флуоресцентная микроскопия может быть использована для изучения возмущения экспрессии белков GFP или DsRed под действием тканеспецифического промотора.
- Быстро отсканируйте 96-луночные планшеты на наличие лунок, в которых по крайней мере 3 из 5 эмбрионов демонстрируют предписанный фенотип «попадания». Запишите идентичность пластины и местоположение скважины каждого потенциального попадания.
- Подтвердите потенциальное попадание путем повторного тестирования эффектов соединения при нескольких дозах (1 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ и 50 мкМ). Для каждой дозы 10 эмбрионов тестируют в 0,5 мл среды Е3 в формате 48-луночных планшетов. Время добавления соединения для повторного тестирования должно быть идентично времени первоначального скрининга. Попадание подтверждается, когда выявленный фенотип воспроизводится при повторном тестировании соединения
- Определите пораженное соединение из базы данных малых молекул в химической библиотеке.