1. Подготовка эмбрионов/личинок
- Перенесите 100 эмбрионов в чашку Петри диаметром 100 мм с 25 мл яичной воды. Держите не более 100 эмбрионов в чашке Петри и выращивайте их при температуре 28 °C.
- Чтобы подавить пигментацию, добавьте фенилтиомочевину (PTU) в чашки Петри до 10 часов после оплодотворения (HPF) и выращивайте эмбрионы/личинки до 80 hpf. Конечная концентрация ПТУ составляет 0,2 мМ.<бр/>
ВНИМАНИЕ: ПТУ токсична. Используйте в соответствии с соответствующими инструкциями по обращению.
- Обезболите личинок, добавив этиловый эфир 3-аминобензойной кислоты (трикаин) в конечной концентрации 0,016% в чашки Петри. Затем с помощью эпифлуоресцентного микроскопа сортируют CFP-положительных личинок. Используйте личинки с похожим размером печени и откажитесь от тех, у которых печень меньше или больше.
ПРИМЕЧАНИЕ: можно использовать любые CFP-положительные личинки, независимо от интенсивности, поскольку нет никакой разницы в степени абляции гепатоцитов между гемизиготными и гомозиготными личинками.
ВНИМАНИЕ: трикаин токсичен. Используйте в соответствии с соответствующими инструкциями по обращению.
- Удалите яичную воду, содержащую трикаин, и добавьте яичную воду с добавлением 0,2 мМ PTU. Храните эмбрионы/личинки при температуре 28 °C.
2. Лечение Mtz
- Приготовьте свежий 10 мМ раствор Мтц, растворив 0,171 г порошка Мтз в 100 мл яичной воды с добавлением 0,2% ДМСО и 0,2 мМ ПТУ. Для полного растворения МТЗ перемешайте раствор по РТ при быстром перемешивании в течение 20-30 минут. Чтобы помочь солюбилизировать Mtz и усилить проникновение Mtz в личинки, добавьте ДМСО при приготовлении Mtz.
ВНИМАНИЕ: длительное воздействие или повышенная концентрация Mtz токсичны. Используйте в соответствии с соответствующими инструкциями по обращению.
- Разделите личинок на контрольную и экспериментальную группы, перенеся нужное количество личинок в две разные 100-миллиметровые чашки Петри или многолуночные планшеты. Для опытной группы держать личинок в растворе 10 мМ Мтц; для контрольной группы держите их в яичной воде, содержащей 0,2% ДМСО.
- Накройте тарелки или чашки Петри, содержащие раствор Mtz, алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фотоинактивацию Mtz, и инкубируйте при 28 °C. Длительность лечения МТЗ зависит от личиночной стадии и трансгенной линии.
3. Анализ билиарной регенерации печени
- По окончании абляционного периода удалите раствор Mtz с пластин. Вымойте обработанные Mtz личинки, добавив 25 мл яичной воды. Прокрутите пластину 2-3 раза, чтобы промыть личинок, прежде чем сбросить воду из яйца. Повторите три раза, а затем еще раз погрузите личинок в яичную воду. Чтобы избежать отека сердца и гибели личинок у личинок, обработанных Mtz, добавьте более низкую концентрацию трикаина, до конечной концентрации 0,008%, чтобы обездвижить личинок.
- Для анализа печени исследуйте размер печени личинок, обработанных Mtz, под эпифлуоресцентным микроскопом с фильтром CFP. Оценивайте уровни абляции гепатоцитов в зависимости от относительного размера печени: большие (без абляции; 0-10% личинок), средние (частично аблятированные; 10-20%) и очень маленькие (полностью аблятированные; 80-90%).
