Инъекция морфолино: метод подавления экспрессии генов-мишеней для изучения функции у рыбок данио-рерио

Аннотация

Источник: Hyde D.R., et al. In vivo Электропорация морфолино в регенерирующий хвостовой плавник взрослой рыбки данио. J. Vis. Exp. (2012)

Протокол описывает целевое подавление экспрессии генов у рыбок данио-рерио путем введения морфолино в хвост.

Протокол

1. Инъекция морфолино

1. За день до введения морфолино сделайте инъекционную пластину (рисунок 1). Обязательно вырезайте выемку на одном конце лунки, которая помогает стабилизировать рыбу для процедуры микроинъекции.
2. Разведите морфолино с флуоресцеином до нужной концентрации (рекомендуется начать с 1,2 мМ) и поместите на водяную баню при температуре 65 °C на 5 минут.
3. Загрузите иглу с морфолино (примечание: в зависимости от того, заправляете ли вы иглу обратно или спереди, будет зависеть, нагрузите ли вы иглу сначала или сначала отрежете кончик).
4. Отрежьте кончик от иглы под углом.
5. Следуйте указаниям вашей системы микроинъекций, чтобы ввести примерно 5 нл пузырька морфолино за одну инъекцию. Большие объемы морфолино могут нарушить ткань.
6. Обезболите рыбу и поместите на инъекционную пластину. Удалите всю лишнюю жидкость и сориентируйте иглу в соответствующее место, как раз дистальнее костного луча (рисунок 2). Используя микроскоп и аппарат для микроинъекций, подходящий для инъекций морфолино (см. Таблицу специфических реагентов), введите морфолино в плавник спереди назад, как показано на рисунке 2. Инъекция с задней на переднюю приводит к сворачиванию плавниковой ткани во время инъекции и очень затруднена.
7. Осторожно введите иглу в регенеративную ткань, дистальнее каждого костного луча (обозначено «1» на рисунке 2) и надавливайте дистально до тех пор, пока не окажется в бластеме (обозначено «2» на рисунке 2). Будьте осторожны, чтобы не протолкнуть иглу через весь плавник. Когда игла будет правильно локализована, ввести морфолино (т.е. нажать один раз). При концентрации 1,2 мМ раствор морфолино, меченный флуоресцеином, выглядит желто-зеленым цветом даже при нормальных условиях освещения. При каждой инъекции может визуализироваться желтая «затяжка» раствора морфолино, что помогает локализовать инъекцию до бластемы. Следует вводить примерно 75 нл (10-15 кликов) раствора морфолина на один костный луч. Пауза ~ 1 сек между кликами. Мы вводим только дорсальную сторону, используя вентральную в качестве электропорационного контроля.

Результаты

Рисунок 1. А. Схема инъекционной пластины, которая изготовлена из агарозы и содержит небольшую лунку для удержания рыбы во время микроинъекции морфолино.

Рисунок 2. Схема микроинъекции морфолино. А. Поместите рыбу в чашку так, чтобы голова рыбы находилась в вырезанной из лунки...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Морфолино	ООО «ГенТулс»		Морфолино должен быть специально разработан в соответствии с вашим интересным белком
Микронасос впрыска	Уорлд Прецизионные Инструменты, Инк.	ПВ830	Пневматический PicoPump Можно использовать множество различных систем микровпрыска
Микроманипулятор	Уорлд Прецизионные Инструменты, Инк.	MMJR	Правша (MMJL для левшей)
Иглы для микроинъекций, наружный диаметр 1,0 мм	Уорлд Прецизионные Инструменты, Инк.	1В100Ф-4	Это капилляры боросиликатного стекла, втянутые в иглу
Иглодержатель	Уорлд Прецизионные Инструменты, Инк.	5430-ВСЕ	Комплект насадок Pico; убедитесь, что вставлена прокладка пипетки диаметром 1,0 мм
Съемник игл	Саттер Инструмент Ко.	-97	Другие устройства для вытягивания микропипеток/игл также должны подойти
микроскоп	Leica, Nikon, Zeiss	Количество варьируется в зависимости от производителя	Любой стереомикроскоп с 20-кратной оптикой и возможностью работы с микроманипуляторами
2-Феноксиэтанол	Сигма-Олдрич	77861-1Л	Анестезия; развести 1:1000 в воде рыбьей системы для процедуры, 1:500 для эвтаназии

.