Спаривание и стадирование яиц: метод получения эмбрионов и их сортировки по стадиям развития

Abstract

Источник: Hostelley T.L., et al. Подготовка образцов и анализ данных экспрессии генов на основе RNASeq у рыбок данио. J. Vis. Exp. (2017)

В статье описывается протокол создания эмбрионов данио-рерио путем естественного спаривания и сортировки их стадий развития. Протокол в дальнейшем используется для анализа β-клеток поджелудочной железы с использованием трансгенных рыб.

Protocol

1. Получение эмбрионов путем естественного спаривания

1. Культивируют эмбрионы до 3-месячного возраста, репродуктивной зрелости.
2. Отделите взрослых самцов и самок рыб от желаемого сорта в разделенные брачные резервуары вечером накануне сбора эмбрионов и добавьте 2 самца и 3 самки в каждый аквариум><. Примечание: Использование трансгенного штамма флуоресцентного репортера insulin2a:mCherry позволило провести анализ β-клеток поджелудочной железы.
3. Пересадите рыб в брачный резервуар с пресной водой и снимите разделитель сразу после того, как на следующее утро загорится свет.
4. Позвольте рыбам спариваться естественным образом, пока эмбрионы не будут замечены в донном аквариуме. Собирайте эмбрионы с интервалом в 30 минут, пока не будет собрано желаемое количество. Храните каждый собранный момент времени в отдельных чашках Петри в эмбриональной среде при температуре 28,5 °C.
5. При желании выполните микроинъекцию генетического материала или помещение в экспериментальные питательные среды и культивируйте эмбрионы в свежей среде для эмбрионов Хэнка в 10-сантиметровых чашках Петри при температуре 28,5 °C.
   Примечание: При анализе экспрессии генов у инъекционных морфолино (МО) или мутантных животных обратите внимание, что каждая манипуляция может оказывать случайное воздействие на экспрессию генов. Мутанты могут проявлять генетическую компенсацию на уровне транскрипции, которая не наблюдается при нацеливании генов на основе MO.

2. Стадия эмбрионов

1. Культивируйте эмбрионы в группах по 50–75 эмбрионов на 10-сантиметровую чашку Петри, чтобы обеспечить согласованное время развития всех эмбрионов.
2. Мониторинг морфологии развития с помощью препарирующего микроскопа на стадиях бластомера, эпиболии и сомита для обеспечения прогрессии развития.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите все умирающие или уродливые эмбрионы, чтобы предотвратить задержку развития в блюде.
3. Разделяйте эмбрионы в зависимости от возраста развития. Стадирование эмбрионов и личинок с использованием общей длины тела после 24 hpf.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сомиты представляют собой мезодермальную ткань в форме шеврона, присутствующую на дорсальной части эмбриона.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ins2a:mCherry	ZIRC	ЗЛ1483
Сопрягаемые баки 1,0 л Crossing Tank Set	Акванерия	ZHCT100
Препарирующий микроскоп	Цейсс