Экстракция ДНК из хвостовой клипсы: метод, используемый в генотипировании рыбок данио

Аннотация

Источник: Xing L., et al. Быстрое и эффективное генотипирование рыбок данио-рерио с использованием ПЦР с анализом расплава с высоким разрешением. J. Vis. Exp. (2014).

В этой статье описывается извлечение ДНК из клипсы для хвоста рыбки данио. Протокол демонстрирует быстрый и эффективный метод анализа генотипов рыбок данио.

Протокол

1. Подготовка ДНК

1. Готовят буфер для лизиса ДНК: 50 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Добавьте свежую протеиназу К до конечной концентрации 1 мг/мл в день использования.
2. Сбор тканей:
   1. Для взрослой рыбы клипса плавников:
      1. Обезболите рыб: поместите рыбу в 0,004% раствор MS-222 (трикаин). Подождите, пока движение жабр замедлится.
      2. Выложите рыбу в стопку по 5-10 кимвайпов и отрежьте небольшой кусочек хвостового плавника, примерно 2-3 мм, стерильным лезвием бритвы.
      3. Быстро поместите рыб в промаркированный аквариум с пресной водой для восстановления; тщательно промаркируйте аквариум и соответствующую трубку, в которой будет находиться зажим для плавников. Меняйте воду и кормите рыбок через день.
      4. Возьмите зажим для плавника со стерильным наконечником для пипетки и переложите его в пробирку, заполненную буфером для лизиса ДНК объемом 100 мкл.
      5. Выбросьте наконечник пипетки и лезвие бритвы в контейнер для острых предметов.
   2. Для зажима хвоста эмбриона:
      1. Поместите эмбрионы в 0,004% раствор MS-222 (трикаин). Подождите 2 минуты.
      2. Отрежьте кусок хвоста щипцами под препарирующим микроскопом.
      3. Поместите хвост в помеченную пробирку, заполненную буфером для лизиса ДНК объемом 30 мкл.
      4. Быстро поместите эмбрион в пробирку, содержащую 100 мкл 4% параформальдегида.
      5. Пробирки с эмбрионами и соответствующими им хвостовыми трубками.
      6. Храните пробирки с эмбрионами при температуре 4 °C в течение ночи для фиксации.
      7. Очистите щипцы водой Milli-Q и салфетками Kimwipes между каждым эмбрионом, чтобы свести к минимуму загрязнение.
   3. Для цельных эмбрионов:
      1. Поместите эмбрионы в 0,004% раствор MS-222 (трикаин). Подождите 2 минуты.
      2. Поместите 1-5 эмбрионов в пробирку, заполненную буфером для лизиса ДНК объемом 100 мкл. Дехорионация не обязательна.
3. Расщепление ДНК
   Инкубируйте пробирки с тканью (зажимы плавника или хвоста или эмбрионы) при температуре 55 °C в течение 4 часов до ночи.
4. Инактивировать протеиназу K
   Нагрейте трубки до 95 °C в течение 15 мин. ДНК следует использовать для ПЦР немедленно или хранить при температуре -20 °C до 3 месяцев.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
100 Реакция LightScanner Мастер-микс	БиоФайр	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Трикаин
Параформальдегид