Подготовка образцов методом световой листовой микроскопии: монтаж живых эмбрионов данио-рерио для долгосрочной визуализации

Abstract

Источник: Icha J., et al. Использование флуоресцентной микроскопии светового листа для визуализации развития глаз рыбок данио. J. Vis. Exp. (2016).

В этой статье описывается подготовка образцов для флуоресцентной микроскопии световых листов. В нем также демонстрируется метод монтирования живых эмбрионов рыбок данио для долгосрочной визуализации, который позволяет записывать длительные покадровые фильмы живых эмбрионов в условиях, близких к физиологическим.

Protocol

1. Подготовка образцов

1. Готовим агарозную смесь
   1. За 15 мин до приготовления агарозной смеси растопить одну аликвоту 1% агарозы с низкой температурой плавления 1% (растворенную в среде Е3) в нагревательном блоке, установленном до 70 °С. Как только агароза полностью расплавится, перелейте 600 μл в свежую пробирку объемом 1,5 мл, добавьте 250 μл среды E3, 50 μл 0,4% MS-222 и 25 μл раствора вихревого шарика.
      заметка: Это составляет 925 μл смеси, в то время как дополнительные 75 μл рассчитываются на жидкость, добавленную позже вместе с эмбрионами.
   2. Держите пробирку во втором нагревательном блоке при температуре 38-40 °C или убедитесь, что агароза находится очень близко к точке гелеобразования, прежде чем помещать в нее образцы эмбрионов.
2. Посадка эмбрионов
   1. Возьмите пять стеклянных капилляров объемом 20 мкл (с черной меткой, внутренний диаметр ~1 мм) и вставьте в них подходящие плунжеры с тефлоновым наконечником. Протолкните поршень через капилляр так, чтобы тефлоновый наконечник оказался на дне капилляра.
   2. Перенесите пять эмбрионов (количество, которое можно установить одновременно) с помощью стеклянной или пластиковой пипетки в пробирку с вихревой теплой агарозной смесью с температурой 37 °C.
      заметка: Постарайтесь перенести с собой минимальный объем жидкости вместе с эмбрионами.
   3. Вставьте капилляр в смесь и всосайте внутрь один эмбрион, потянув поршень вверх. Следите за тем, чтобы головка эмбриона попала в капилляр раньше хвоста. Избегайте попадания пузырьков воздуха между поршнем и образцом. Над зародышем должно быть ±2 см агарозы, а ниже него – ±1 см. Повторите то же самое для остальных эмбрионов.
   4. Подождите, пока агароза полностью застынет, что произойдет в течение нескольких минут, а затем храните образцы в среде Е3, приклеив их к стенке стакана с помощью пластилина или скотча. Нижнее отверстие капилляра должно свободно висеть в растворе, что позволяет осуществлять газообмен к образцу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, аналогичный разделам 1.1 и 1.2, также можно найти на странице OpenSPIM wiki http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.

2. Позиционирование образца

1. Узел держателя образца
   1. Вставьте 2 пластиковые втулки нужного размера (черные) друг против друга в стержень держателя образца. Их щелевые стороны должны быть обращены наружу. Прикрепите зажимной винт свободно, повернув его на 2-3 оборота. Вставьте капилляр через зажимной винт и протолкните его через держатель, пока черная полоса не станет видна с другой стороны. Не прикасайтесь к поршню.
   2. Затяните зажимной винт. Вытолкните лишний 1 см агарозы ниже зародыша из капилляра и разрежьте его. Вставьте стержень в диск держателя образцов.
   3. Подтвердите в программном обеспечении, что предметный столик микроскопа находится в положении загрузки. С помощью направляющих направляйте весь держатель с образцом вертикально вниз в микроскоп. Поверните его так, чтобы диск магнитного держателя зафиксировался в нужном положении.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Микроскоп Lightsheet Z.1	Микроскопия Carl Zeiss
Низкая температура плавления агарозы	Рот	6351.1 Корпус 6351.1
Низкая температура плавления агарозы	сигма	А4018 или А9414
Этил3-аминобензоат метансульфонат (MESAB / MS-222 / трикаин)	сигма	Е10521
20 μл (внутренний диаметр 1 мм, обозначен черным цветом) капилляры	клеймо	701904	Продается в качестве запасной части для TransferPettor
Плунжеры с тефлоновым наконечником для капилляров объемом 20 мкл	клеймо	701932	Продается в качестве запасной части для TransferPettor