Подготовка образцов методом световой листовой микроскопии: монтаж живых эмбрионов данио-рерио для долгосрочной визуализации

Аннотация

Источник: Icha J., et al. Использование флуоресцентной микроскопии светового листа для визуализации развития глаз рыбок данио. J. Vis. Exp. (2016).

В этой статье описывается подготовка образцов для флуоресцентной микроскопии световых листов. В нем также демонстрируется метод монтирования живых эмбрионов рыбок данио для долгосрочной визуализации, который позволяет записывать длительные покадровые фильмы живых эмбрионов в условиях, близких к физиологическим.

Протокол

1. Подготовка образцов

1. Готовим агарозную смесь
   1. За 15 мин до приготовления агарозной смеси растопить одну аликвоту 1% агарозы с низкой температурой плавления 1% (растворенную в среде Е3) в нагревательном блоке, установленном до 70 °С. Как только агароза полностью расплавится, перелейте 600 μл в свежую пробирку объемом 1,5 мл, добавьте 250 μл среды E3, 50 μл 0,4% MS-222 и 25 μл раствора вихревого шарика.
      заметка: Это составляет 925 μл смеси, в то время как дополнительные 75 μл рассчитываются на жидкость, добавленную позже вместе с эмбрионами.
   2. Держите пробирку во втором нагревательном блоке при температуре 38-40 °C или убедитесь, что агароза находится очень близко к точке гелеобразования, прежде чем помещать в нее образцы эмбрионов.
2. Посадка эмбрионов
   1. Возьмите пять стеклянных капилляров объемом 20 мкл (с черной меткой, внутренний диаметр ~1 мм) и вставьте в них подходящие плунжеры с тефлоновым наконечником. Протолкните поршень через капилляр так, чтобы тефлоновый наконечник оказался на дне капилляра.
   2. Перенесите пять эмбрионов (количество, которое можно установить одновременно) с помощью стеклянной или пластиковой пипетки в пробирку с вихревой теплой агарозной смесью с температурой 37 °C.
      заметка: Постарайтесь перенести с собой минимальный объем жидкости вместе с эмбрионами.
   3. Вставьте капилляр в смесь и всосайте внутрь один эмбрион, потянув поршень вверх. Следите за тем, чтобы головка эмбриона попала в капилляр раньше хвоста. Избегайте попадания пузырьков воздуха между поршнем и образцом. Над зародышем должно быть ±2 см агарозы, а ниже него – ±1 см. Повторите то же самое для остальных эмбрионов.
   4. Подождите, пока агароза полностью застынет, что произойдет в течение нескольких минут, а затем храните образцы в среде Е3, приклеив их к стенке стакана с помощью пластилина или скотча. Нижнее отверстие капилляра должно свободно висеть в растворе, что позволяет осуществлять газообмен к образцу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, аналогичный разделам 1.1 и 1.2, также можно найти на странице OpenSPIM wiki http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.

2. Позиционирование образца

1. Узел держателя образца
   1. Вставьте 2 пластиковые втулки нужного размера (черные) друг против друга в стержень держателя образца. Их щелевые стороны должны быть обращены наружу. Прикрепите зажимной винт свободно, повернув его на 2-3 оборота. Вставьте капилляр через зажимной винт и протолкните его через держатель, пока черная полоса не станет видна с другой стороны. Не прикасайтесь к поршню.
   2. Затяните зажимной винт. Вытолкните лишний 1 см агарозы ниже зародыша из капилляра и разрежьте его. Вставьте стержень в диск держателя образцов.
   3. Подтвердите в программном обеспечении, что предметный столик микроскопа находится в положении загрузки. С помощью направляющих направляйте весь держатель с образцом вертикально вниз в микроскоп. Поверните его так, чтобы диск магнитного держателя зафиксировался в нужном положении.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микроскоп Lightsheet Z.1	Микроскопия Carl Zeiss
Низкая температура плавления агарозы	Рот	6351.1 Корпус 6351.1
Низкая температура плавления агарозы	сигма	А4018 или А9414
Этил3-аминобензоат метансульфонат (MESAB / MS-222 / трикаин)	сигма	Е10521
20 μл (внутренний диаметр 1 мм, обозначен черным цветом) капилляры	клеймо	701904	Продается в качестве запасной части для TransferPettor
Плунжеры с тефлоновым наконечником для капилляров объемом 20 мкл	клеймо	701932	Продается в качестве запасной части для TransferPettor