$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка эмбрионов
- После спаривания соберите эмбрионы в E3 в чашке Петри и инкубируйте их при температуре 26,5 °C в течение примерно 28 часов перед посадкой.
заметка: Это замедляет развитие эмбрионов, так что в начале визуализации эмбрионы находятся примерно на стадии 30 сомитов.
- Обезболить эмбрионы в 0,016-0,020% трикаином в Е3. Чтобы подавить пигментацию, добавьте ПТУ в концентрации 200 мкМ.
- Дехорионировать эмбрионы с помощью щипцов под препарирующим микроскопом. С помощью двух щипцов возьмитесь за хорион и аккуратно раздвиньте его, чтобы освободить эмбрион.
2. Монтаж в агарозе
ПРИМЕЧАНИЕ: Разработанный метод монтажа требует двух разных концентраций низкоплавкой агарозы в E3 с 0,02% трикаина и PTU по мере необходимости. Первый раствор агарозы содержит оптимальную концентрацию агарозы, при которой искажение и подвижность минимальны. Оптимизация описана в шаге 5 ниже.
- Нагрейте агарозные растворы для двух слоев (концентрация, определенная на шаге 5 ниже, и 1%) до 65 °C. Дайте агарозе остыть примерно до 30 °C непосредственно перед посадкой, чтобы эмбрион не пострадал от тепла. Для монтажа используйте посуду со стеклянным дном 35 мм с крышкой No 0 стеклянным дном. Покровное стекло, прикрепленное к дну посуды, создает неглубокий углубление 10 мм (глубиной около 1,2 мм), в которое будет помещен эмбрион.
заметка: В этом случае концентрация с наименьшей подвижностью и искажениями составляла от 0,025 до 0,040% агарозы.
- Аккуратно поместите дехорионизированный эмбрион одной из его боковых сторон к дну чашки с помощью стеклянной пипетки или микропипетки. Если вы используете микропипетку, разрежьте внешнюю часть наконечника, чтобы увеличить размер отверстия в соответствии с размерами эмбриона (рисунок 1A). Осторожно удалите остатки E3 с помощью микропипетки.
- Добавьте первый раствор агарозы в небольшое углубление, созданное покровным стеклом, прикрепленным к дну посуды, чтобы покрыть зародыш (слой 1) (рисунок 1B). Следите за тем, чтобы агароза закрывала маленькую лунку, но не переполняла ее.
- Накройте маленькую лунку покровным стеклом (22 мм x 22 мм) (Рисунок 1C), чтобы создать узкое заполненное агарозой пространство с зародышем между двумя покровными стеклами.
- Нанесите слой 1% раствора агарозы поверх покровного стекла по всему дну посуды (слой 2) (рисунок 1D). По мере затвердевания этого слоя он удерживает покровное стекло на месте.
- Наполните оставшуюся часть чашки веществом E3, содержащим 0,02% трикаина, чтобы поддерживать водный баланс в организме (слой 3) (рисунок 1E).
заметка: В этой конфигурации покровное стекло и 1% агароза защищают нижний слой от разбавления.
3. Оптимизация агарозного раствора для слоя 1
- Чтобы определить оптимальную концентрацию агарозы для слоя 1, используйте подход многомасштабного сеточного поиска. Монтируют эмбрионы в возрастающих концентрациях агарозы в диапазоне от 0,01% до 1% с последующей покадровой визуализацией ограничения роста и подвижности эмбрионов в поле зрения. Определите концентрации, при которых искажение и подвижность минимальны.
- Для дальнейшей оптимизации концентрации агарозы зародыши используют более тонкий диапазон концентраций агарозы (например, от 0,025 до 0,040% агарозы) в зависимости от концентрации, которая оказалась наилучшей на стадии 3.1 (например, 0,025%, 0,028%, 0,031% и т.д.).
заметка: В нашей лаборатории оптимальная концентрация агарозы составляла около 0,03%.
