$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Настройка, получение, обработка и анализ изображений микроскопа
- Приготовьте 0,8% агарозу с низкой температурой плавления (LMP): Добавьте 0,8 г LMP агарозы в 100 мл E3 и нагрейте до полного растворения. В горячем состоянии аликвот 1 мл агарозы LMP в микропробирки объемом 1,5 мл в нагревательном блоке при температуре 37 °C. Агароза LMP останется расплавленной при 37 °C. Добавьте 40 мкл 4 мг/мл (25x) с pH 7,0 трикаина на каждый 1 мл аликвоты LMP агарозы при 37 °C. ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с пигментированным штаммом добавьте 20 мкл 0,15% (50x) PTU на каждый 1 мл аликвоты.
- Храните оставшуюся агарозу LMP в течение нескольких месяцев в герметичных пробирках по 50 мл при температуре 4 °C.
- Обезболите парабиотические эмбрионы, которые будут визуализированы, добавив 1 мл 4 мг/мл (25x), pH 7,0 трикаина к 25 мл E3, в которых эмбрионы уже находятся.
- Аккуратно перемешайте блюдо, чтобы эмбрионы скапливались в середине. Затем с помощью пластиковой пипетки для переноса с широким наконечником наберите эмбрионы в как можно меньшее количество жидкости. Переверните пипетку вертикально и осторожно подпрыгивайте эмбрионы, чтобы они осели на самое дно пипетки.
- Когда эмбрионы находятся на дне пипетки, перенесите их в аликвоту 1 мл агарозы LMP, слегка коснувшись кончика пипетки к поверхности агарозы. Избегайте переноса лишней жидкости, так как это разбавит агарозу.
- После удаления лишней жидкости из пипетки с помощью пипетки осторожно перемешайте зародыши внутри агарозы, затем с помощью пипетки перенесите всю агарозу и зародыши в лунку со стеклянным дном (покровная крышка No 1,5), 6-луночная пластина.<бр/>
заметка: Обязательно выбросьте пипетку после переноса эмбрионов в рентгенографическую пластину. Остатки агарозы утвердятся внутри пипетки, что сделает ее непригодной для дальнейшего использования. Вместо этого каждый раз используйте новую пипетку.
- Под стереоскопом используйте наконечник пипетки, загружающий гель, закрепленный на конце иглы с деревянной ручкой, чтобы расположить эмбрионы вниз по направлению к покровному стеклу (чтобы убедиться, что они находятся в пределах рабочего расстояния от объектива микроскопа) и в желаемой ориентации для визуализации.
заметка: Повторяйте в непрерывном положении до полного схватывания агарозы. Позаботьтесь о том, чтобы установить парабиотические эмбрионы, в соответствии с которыми эмбрион пары будет визуализирован. Учитывая случайную ориентацию сросшихся эмбрионов, для некоторых пар может быть трудно визуализировать оба эмбриона. В этом сценарии извлеките эмбрионы из агарозы с помощью щипцов и пластиковой пипетки с широким наконечником, а затем снова установите их для визуализации с другой точки зрения.
- Как только агароза застынет, накройте 2 - 3 мл Е3 с добавлением трикаина (и ПТУ при необходимости).
- Визуализируйте эмбрионы с помощью инвертированного широкопольного эпифлуоресцентного, лазерного сканирующего конфокального микроскопа или конфокального микроскопа с вращающимся диском. Выберите цель, наиболее подходящую для желаемого изображения. Для поля зрения всего эмбриона используйте объектив с 4-кратным увеличением. Выберите более высокое увеличение, например 20-кратный объектив, для получения изображения определенной ткани
заметка: Если вы используете вертикальный микроскоп, установите его в агарозный LMP (аналогично приведенному выше) на стеклянную крышку. Переверните стеклянный покровный стекло на предметное стекло микроскопа с кольцом вакуумной смазки, заполненным тем же E3-трикаином-PTU.
- Обрабатывайте полученные изображения с помощью бесплатных пакетов программного обеспечения для анализа изображений, таких как NIH Image J/FIJI.
заметка: Подсчитывайте количество клеток и количественно оценивайте динамику, такую как миграция клеток и деление клеток, с помощью алгоритмов сегментации и отслеживания.