1: Двухфотонная аксотомия с использованием специально изготовленного двухфотонного микроскопа с лазером Chameleon Ti-Sapphire
- Подготовьтесь к визуализации. Поместите установленный эмбрион (эмбрионы) на предметное стекло под микроскопом. Сосредоточьтесь на одном эмбрионе с 40-кратным (0,8 NA) объективом для воды. Включите лазер. Нам удалось воспроизвести визуализацию и повреждение нейронов, экспрессирующих GFP, с помощью следующих параметров. Чтобы визуализировать аксоны при неповреждающей мощности, установите лазер на длину волны 910 нанометров (нм) и мощность 30 милливатт (мВт указаны как мощность образца). Откройте программное обеспечение для обработки изображений. Мы используем программное обеспечение ScanImage, разработанное в лаборатории Карела Свободы.
- Нажмите кнопку фокусировки, чтобы отсканировать эмбрион с помощью двухфотонного лазера, найдите аксон, который вы хотите аксотомировать, и сделайте снимок этого аксона. Отметьте первую и последнюю позиции Z, получите изображение и сделайте максимальную проекцию стеков Z.
- Увеличьте 70-кратное увеличение ветви аксона, которую вы хотите аксотомизировать, и остановите сканирование. Увеличьте мВт на образце до разрушительной мощности 180 мВт и выполните однократное сканирование с помощью лазера. Для этого мы устанавливаем количество Z срезов равным 1 и нажимаем «Grab». Этого должно быть достаточно, чтобы разорвать аксон. В обсуждении описаны методы оптимизации этой процедуры для вашего микроскопа и экспериментальной цели.
- Уменьшите масштаб, уменьшите мощность до 30 мВт и сделайте снимок.
2: Двухфотонная аксотомия на конфокальном/двухфотонном микроскопе Zeiss 510
- Поместите установленный эмбрион на сцену и сфокусируйте его с помощью 25-кратного водяного объектива или другого подходящего объектива.
- Включите двухфотонный (910 нм) и аргоновый (488 нм) лазеры в многодорожечном режиме, чтобы можно было переключаться с одного на другой. Хотя оба лазера используются для обнаружения GFP, двухфотонное излучение визуализируется красным цветом, а излучение аргонового лазера — зеленым, чтобы различать их.
- Используйте аргоновый лазер, чтобы определить аксон, который нужно ранить. В разделе «Настройки Z» отметьте первый и последний оптические участки. Сделайте конфокальное изображение и создайте максимальную проекцию стека Z.
- Выберите область аксона, которую нужно травмировать, и сфокусируйте внимание на этой области. Выключите аргоновый лазер и включите двухфотонный лазер. Отсканируйте образец с помощью двухфотона с интенсивностью пропускания лазера ~9%, чтобы убедиться, что аксон все еще находится в фокусе.
- Нажмите кнопку «стоп», чтобы инструмент обрезки был доступен. Используйте обрезку для увеличения области интереса. Обычно мы увеличиваем масштаб до ~70X (зум можно проверить во вкладке "режим"). На вкладке "каналы" измените интенсивность двухфотонного пропускания с ~9% на 15-20% пропускания.
- Чтобы разорвать аксон, активируйте кнопку "fast XY" примерно на 1 секунду, а затем нажмите кнопку стоп, чтобы избежать чрезмерного урона. Аксон следует рассматривать как разбросанный мусор, если процедура сработала.
- Чтобы убедиться, что аксон был поврежден, переключитесь обратно на аргоновый лазер с длиной волны 488 нм, сделайте еще одно конфокальное изображение, и создайте максимальную проекцию.
