$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Монтирование личинок для экспериментов по поведению
- Приготовьте агарозу с низким содержанием плавления 1,5% в ddH2O и храните в нагревательном блоке при температуре 42 °C, чтобы предотвратить его затвердевание.
- С помощью стеклянной пастеровской пипетки перенесите одну из предварительно отсеянных личинок в пробирку с 1,5% низкоплавкой агарозой с минимальным количеством синей/зародышевой воды.
- Перенесите личинок в капле агарозы на небольшую чашку Петри.
- Под препарирующим микроскопом расположите личинку спинным ходом вверх.
- Когда агароза застынет, отрежьте агарозу тонким бритвенным лезвием (скальпель #11), оставив клин агара вокруг всей личинки.
- Сделайте два диагональных надреза по обе стороны от желтка; следите за тем, чтобы не поцарапать личинку.
- Заполните область вокруг агарозы зародышем/голубой водой.
- Вытяните агарозу в сторону от туловища и хвоста личинки (рисунок 1).
2 . Подготовка высокоскоростной камеры и программного обеспечения для обработки изображений
- Установите высокоскоростную камеру на препарирующий прицел.
- Подключите камеру к компьютеру.
- Включите компьютер.
- Включите высокоскоростную камеру.
- Откройте программное обеспечение для работы с видео/изображениями (Мы используем программное обеспечение для работы с изображениями AOS и опишем процедуры его использования здесь, но другое программное обеспечение для обработки изображений также приемлемо).
- Отрегулируйте настройки камеры соответствующим образом (т.е. 1 000 кадров в секунду (кадров в секунду), 50% буфер триггера или другие предпочтительные настройки).
- Начните запись.
3. Активируйте одиночные нейроны с помощью лазера с длиной волны 473 нм
- Подключите стимулятор, лазер и оптический кабель.
- Включите стимулятор.
- Установите стимулятор на максимум 5 Вольт и длительность импульса 5 мс.
- Включите лазер в соответствии с инструкцией производителя.
- С помощью препарирующего микроскопа расположите кончик оптического кабеля рядом с клеточным телом нейрона с экспрессией ChEF-tdTomato (рис. 1).
- Подайте импульс синего света для активации сенсорных нейронов.
- Записывайте поведение с помощью высокоскоростной камеры со скоростью 500 или 1 000 кадров в секунду.
- Повторяйте эксперимент по желанию, подождая 1 минуту между каждой активацией, чтобы избежать привыкания. (Мы записываем как минимум три реакции для каждого нейрона).
- Чтобы выпустить личинок, подденьте щипцами агарозу, стараясь не травмировать животное. Этому животному можно позволить развиваться дальше, и процедуру можно повторить на более ранней стадии, чтобы охарактеризовать развитие поведения. Эмбрион также может быть повторно установлен для конфокальной визуализации активированной клетки с высоким разрешением, чтобы коррелировать поведение с клеточной структурой, как описано ниже.
- Перенесите личинку в культуральную тарелку со свежей голубой/эмбриональной водой. Мы используем 24-луночный планшет для отслеживания отдельных личинок.
