Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Abstract

Источник: Palanca A. M. S., et al. Оптогенетическая активация соматосенсорных нейронов рыбок данио-рерио с использованием ChEF-tdTomato. J. Vis. Exp. (2013).

Это видео описывает оптогенетические методы активации генетически модифицированных соматосенсорных нейронов и записи вызванных поведенческих реакций с помощью высокоскоростной видеокамеры.

Protocol

1. Монтирование личинок для экспериментов по поведению

1. Приготовьте агарозу с низким содержанием плавления 1,5% в ddH2O и храните в нагревательном блоке при температуре 42 °C, чтобы предотвратить его затвердевание.
2. С помощью стеклянной пастеровской пипетки перенесите одну из предварительно отсеянных личинок в пробирку с 1,5% низкоплавкой агарозой с минимальным количеством синей/зародышевой воды.
3. Перенесите личинок в капле агарозы на небольшую чашку Петри.
4. Под препарирующим микроскопом расположите личинку спинным ходом вверх.
5. Когда агароза застынет, отрежьте агарозу тонким бритвенным лезвием (скальпель #11), оставив клин агара вокруг всей личинки.
6. Сделайте два диагональных надреза по обе стороны от желтка; следите за тем, чтобы не поцарапать личинку.
7. Заполните область вокруг агарозы зародышем/голубой водой.
8. Вытяните агарозу в сторону от туловища и хвоста личинки (рисунок 1).

2 . Подготовка высокоскоростной камеры и программного обеспечения для обработки изображений

1. Установите высокоскоростную камеру на препарирующий прицел.
2. Подключите камеру к компьютеру.
3. Включите компьютер.
4. Включите высокоскоростную камеру.
5. Откройте программное обеспечение для работы с видео/изображениями (Мы используем программное обеспечение для работы с изображениями AOS и опишем процедуры его использования здесь, но другое программное обеспечение для обработки изображений также приемлемо).
6. Отрегулируйте настройки камеры соответствующим образом (т.е. 1 000 кадров в секунду (кадров в секунду), 50% буфер триггера или другие предпочтительные настройки).
7. Начните запись.

3. Активируйте одиночные нейроны с помощью лазера с длиной волны 473 нм

1. Подключите стимулятор, лазер и оптический кабель.
2. Включите стимулятор.
3. Установите стимулятор на максимум 5 Вольт и длительность импульса 5 мс.
4. Включите лазер в соответствии с инструкцией производителя.
5. С помощью препарирующего микроскопа расположите кончик оптического кабеля рядом с клеточным телом нейрона с экспрессией ChEF-tdTomato (рис. 1).
6. Подайте импульс синего света для активации сенсорных нейронов.
7. Записывайте поведение с помощью высокоскоростной камеры со скоростью 500 или 1 000 кадров в секунду.
8. Повторяйте эксперимент по желанию, подождая 1 минуту между каждой активацией, чтобы избежать привыкания. (Мы записываем как минимум три реакции для каждого нейрона).
9. Чтобы выпустить личинок, подденьте щипцами агарозу, стараясь не травмировать животное. Этому животному можно позволить развиваться дальше, и процедуру можно повторить на более ранней стадии, чтобы охарактеризовать развитие поведения. Эмбрион также может быть повторно установлен для конфокальной визуализации активированной клетки с высоким разрешением, чтобы коррелировать поведение с клеточной структурой, как описано ниже.
10. Перенесите личинку в культуральную тарелку со свежей голубой/эмбриональной водой. Мы используем 24-луночный планшет для отслеживания отдельных личинок.

Representative Results

Materials

Low Melt agarose 	Sigma	A9045	or equivalent
Petri dish (100×15 mm)	Any	Any
Non-Sterile scalpel blades	Fine Scientific Tools, Inc.	10011-00	or equivalent
blue/embryo water			10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue
High speed camera	AOS Technologies, Inc.	X-PRI (130025-10)	or equivalent
Glass Pasteur pipette	Fisher	1367820B	or equivalent (10-15 mm diameter)
473 nm portable laser	Crystal lasers	CL-473-050	or higher power, with TTL option
S48 Stimulator	Astro-Med, Inc. Grass Instrument division	S48K	or equivalent
Tricaine	Sigma	A5040
200 μm optic fiber	ThorLabs	AFS200/220Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
50 μm optic fiber	ThorLabs	AFS50/125Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
24 culture plates	Genesee	25-102	or equivalent