Вскрытие хрусталика глаза: техника наблюдения за морфологией хрусталика данио-рерио

Аннотация

Источник: Воронцова И. и др., Оценка локализации ядра хрусталика данио-рерио и целостности шва. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео описывает протокол, разработанный для препарирования линз взрослых особей и личинок рыбок данио-рерио для анализа морфологии кортикальных линз и структурной целостности швов хрусталика.

Протокол

1. Вскрытие линз личинок и взрослых особей данио-рерио

1. Обезболивайте рыб от 6 личинок dpf до взрослого возраста трикаином до тех пор, пока они не перестанут реагировать на прикосновения, но все еще будут демонстрировать сильное сердцебиение. Измерьте стандартную длину рыбы по Шиллингу (2002) для стадии.
2. Немедленно иссеките глаза с помощью ножниц для микродиссекции и поместите в чашку для вскрытия в PBS (Рисунок 1 показан для глаз взрослых).
   1. Сделайте на заказ чашку диаметром 35 мм, наполненную силиконом, для вскрытия линз. После того, как силикон застынет, отрежьте углубление диаметром около 2-3 мм и глубиной 0,5 мм для иммобилизации глаз/линз взрослого человека во время вскрытия.
3. Вскрытие линз взрослых рыбок данио рерио
   1. Поместите взрослый глаз в миску углублением задней стороной вверх, наполненную PBS. Иммобилизуйте глаз, вставив щипцы под углом <45° через диск зрительного нерва. Будьте осторожны, чтобы не поцарапать или не сжать линзу. Сделайте два или три радиальных разреза через сетчатку и склеру от диска зрительного нерва до цилиарной зоны с помощью диссекционных ножниц.
   2. Отклейте сетчатку глаза и склеры, как лепестки цветов, и переверните глаз роговицей вверх. Иммобилизуйте хрусталик косвенно, воздействуя на склеры и роговицу плоской стороной ножниц, одновременно оттягивая сетчатку и прикрепленные ткани щипцами. Аккуратно обрежьте лишнюю ткань с линзы.
      заметка: Очень важно тщательно препарировать, чтобы получить стабильно здоровые линзы.
4. Вскрытие линз личинок данио-рерио
   1. Поместите заднюю сторону глаза личинок вверх на плоскую часть силиконовой чашки, наполненной PBS, и с помощью заточенной вольфрамовой иглы сделайте радиальные надрезы через сетчатку и склеру, одновременно обездвиживая глаз другой вольфрамовой иглой или щипцами.
      заметка: Будьте осторожны, чтобы не повредить объектив.
      1. Электролитически заточите наконечник вольфрамовой проволоки длиной 0,1 мм длиной 2 см, суспензив наконечник проволоки в 10% (по массе) NaOH и подав переменный ток низкого напряжения14. Вставьте иглу в пипетку Пастера, расплавив стеклянный конец с помощью горелки Бунзена.
         заметка: Также можно использовать альтернативные инструменты для тонкого препарирования.
         осторожность: NaOH вызывает коррозию.
   2. Аккуратно вычерпните линзу из диссоциированного глаза тупой стороной иглы, и осторожно оттяните прикрепленную ткань.

Результаты

Рисунок 1: Вскрытие хрусталика данио-рерио. (А) Глаза рассекаются у рыб, находящихся под наркозом, и помещаются задней стороной вверх (В). (C) Глаза обездвиживаются щипцами через диск зрительного нерва (od) и делаются два-три радиальных разреза сетчатки и ск...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Научный центр Фишера	БП399
Тарелка со стеклянным дном (чашка Петри 35 мм, микролунка 14 мм, защитное стекло #1.5)	Корпорация MatTek	П35Г-1.5-14-С
Щипцы Dumont #5	Дюмон и Филс		Держите щипцы заточенными
Ножницы для микродиссекции Vannas	Тед Пелла Инк	1346	Острые/острые прямые кончики
Конфокальный микроскоп	Компания Nikon		Eclipse Ti-E
Гранулы гидроксида натрия	Научный центр Фишера	С612-3	ОСТОРОЖНО - коррозионный/раздражающий для глаз и кожи, органа-мишени - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 дыхательная система, коррозионный для металлов
Одноразовые стеклянные пипетки Пастера	Фишербранд	13-678-20А

г.