Электрофизиология цельноклеточного зажима: метод изучения электрических свойств нейронов

Аннотация

Источник: Рой, Б., и др. Patch Clamp Recordings из эмбриональных клеток данио-рерио Маутнера. J. Vis. Exp. (2013).

Этот протокол описывает технику, называемую электрофизиологией зажима целых клеток, которая представляет собой метод изучения электрических свойств нейронов Маутнера и других ретикулоспинальных клеток в эмбрионах рыбок данио.

Протокол

1. Запись с помощью патч-клетка (режим всей ячейки)

1. Все записи выполняются в режиме clamp whole cell patch. Записывающие камеры размещаются на предметном столике микроскопа в электрофизиологической установке. Наши столики закреплены, а вертикальный микроскоп с накладным зажимом прикреплен болтами к подвижной платформе микроскопа или транслятору микроскопа.
2. Патч-клемовые пипетки натягиваются на горизонтальный съемник (-97; Саттер Инструментс Ко.) из тонкостенного, боросиликатного стекла, полученного из WPI. Диаметр наконечника пипетки составляет порядка 0,2-0,4 мкм после огневой полировки до гладкого края, а длина конуса хвостовика составляет ~4 мм.
3. Прикрепите пипетку к головному столу усилителя в электрофизиологической установке. Важно, чтобы напорный столик находился под углом примерно 45° к горизонтальной оси, так как это обеспечивает угол входа пипетки, подходящий для формирования высокопрочных уплотнений на ячейке Маутнера.
4. Непосредственно перед входом в раствор для ванны надавите на пипетку с небольшим положительным давлением, чтобы снизить вероятность загрязнения наконечника. При регистрации mEPSC растворы для ванн включают 1 мкМ TTX для блокирования потенциалов действия, 5 мкМ стрихнина для блокирования рецепторов глицина и 10 мкМ бикукуллина или 100 мкМ пикротоксина для блокирования рецепторов ГАМК. При регистрации mIPSC растворы для ванн содержат 1 мкМ TTX, кинуреновую кислоту и либо бикукулин, либо стрихнин в зависимости от активности интересующего рецептора.
5. Подойдите к М-ячейке с небольшим количеством положительного давления в пипетке. Положительное давление мягко толкает клетку из стороны в сторону и при расположении непосредственно над клеткой образует небольшую ямочку на клеточной мембране. Оставьте пипетку на месте на несколько секунд, чтобы аккуратно очистить поверхность клетки, чтобы между пипеткой и мембраной могло образоваться прочное уплотнение. Сброс положительного давления в пипетке позволяет инициировать уплотнение, а небольшое отрицательное давление в сочетании с отрицательным потенциалом пипетки приводит к образованию гигаомных уплотнений в течение нескольких секунд.
6. Измените удерживающий потенциал на усилителе на -60 мВ. Разорвите клеточную мембрану серией коротких импульсов всасывания. Немедленная регистрация потенциалов мембраны и минимизация артефактов емкости. Компенсация емкости ячейки (Cm) и сопротивления доступа (последовательно) (Ra) на 70-85%. Ra следует регулярно контролировать, каждые 30 секунд или минуту, и если происходит изменение на 20% или более, прервать эксперимент.
7. После того, как эксперимент завершен и получено достаточно данных, подготовка приносится в жертву путем удаления заднего мозга с помощью пары щипцов. С этого момента можно приступать к анализу данных.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Съемник пипеток	Саттер Инструментс Ко	-97
Вертикальный патч-зажимной микроскоп	Leica Microsystems	DMLFSA
усилитель	Молекулярные приборы	200В
микроманипулятор	Siskiyou Inc.	МХ7500