Внутримышечная (внутримышечная) инъекция: доставка соединения в дорсальную мышцу взрослой рыбки данио-рерио

Аннотация

Источник: Myllymäki, H., et al. Иммунизация взрослых рыбок данио для доклинического скрининга вакцин на основе ДНК. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео описывается техника внутримышечного введения соединений в спинные мышцы взрослой рыбки данио

.

Протокол

1. Инъекция ДНК-вакцины и электропорация

1. Для иммунизации в соответствии с этим протоколом используйте здоровых взрослых рыбок данио в возрасте от 6 до 12 месяцев. Держите рыбу в проточной системе с циклом свет/темнота 14/10 часов, максимум семь рыб на 1 л воды.
2. Приготовьте 0,02% раствор этилового эфира (трикаина) 3-аминобензойной кислоты (рН 7) в воде аквариума для обезболивания рыб. Используйте чашку Петри 10 см или что-то подобное.
3. Подготовьте бак для рекуперации, наполнив стакан объемом 5 л 3 л чистой системной воды.
4. Приготовьте прокладку для вакцинации, чтобы рыба оставалась в фиксированном положении во время вакцинации. Возьмите губку толщиной от 2 до 3 см размером 5 x^{7 см,} 2 см. Прорежьте углубление в губке лезвием скальпеля или острыми ножницами.
   заметка: Одна и та же прокладка для вакцинации может быть использована в нескольких экспериментах. Дезинфицируйте губку между экспериментами, замочив ее в 70% этиловом спирте, и дайте высохнуть.
5. Тщательно замочите губку в воде системы и установите губку на чашку Петри.
6. Голодайте рыбу за 24 часа до прививок.
7. Обезболите одну рыбку данио, поместив ее на чашку Петри, содержащую 0,02% трикаина. Подождите, пока рыба не отреагирует на сенсорную стимуляцию и пока не прекратится движение жабр. Обезболивайте по одной рыбе за раз.
8. С помощью пластиковой ложки переложите обезболенных рыбок данио на влажную губку и установите брюшную сторону рыбы вниз в углубление. В правильном положении следите за тем, чтобы голова и большая часть тела рыбы находились внутри канавки, а спинной плавник и хвост выступали из канавки.
9. Под микроскопом осторожно поместите иглу под углом примерно 45° близко к спинной мышце данио-рерио, используя колеса тонкой настройки по осям X и Y на микроманипуляторе.
10. Найдите небольшое пятнышко без чешуи перед спинным плавником, где нажатие иглы не требует силы. Если вы чувствуете сопротивление, попробуйте найти соседнее место. Избегайте травмирования позвоночника, спинного плавника или чешуи.
    заметка: Если игла изгибается при надавливании, слегка укоротите иглу, разрезав ее.
11. С помощью ножного переключателя постепенно вводите раствор вакцины в мышцу. Понаблюдайте за инъекцией под микроскопом: феноловый красный виден по мере его попадания в мышечную ткань. При необходимости отрегулируйте длительность импульса.
    заметка: В качестве альтернативы для впрыска можно использовать кнопку запуска импульса на передней панели пневматического насоса. Тем не менее, использование дистанционного ножного переключателя позволяет использовать другую руку для регулировки длины импульса с помощью 10-оборотного колеса циферблата. Избегайте слишком быстрого введения раствора, так как это может привести к чрезмерному повреждению тканей. Следите за тем, чтобы не впрыскивать воздух.
12. Электропорировать рыбу следует сразу после инъекции. Следите за тем, чтобы рыба все еще находилась под наркозом. Держите рыбу на губке и установите рыбу между электродами типа пинцета, таким образом, чтобы электроды располагались с каждой стороны от места инъекции. Не нажимайте на пинцет электродов слишком сильно, но держите оба электрода в контакте с рыбой.
    1. Нажмите кнопку запуска на электропораторе, чтобы подать шесть импульсов 40 В, 50 мс.
    2. Аккуратно переложите рыб в резервуар для восстановления.
    3. Очищайте электроды после каждой электропорации, протирая их 70% этанолом.<бр/> заметка: Внимательно следите за самочувствием рыбок после вакцинации. Усыпьте любую рыбу, проявляющую признаки дискомфорта (медленное восстановление после анестезии, аберрантное плавание, задыхание) в 0,04% трикаине. После восстановления переложите рыбу в проточный агрегат и кормите ее в обычном режиме.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Феноловая красная натриевая соль	Сигма-Олдрич	114537-5Г
Трикаин (этил3-аминобензоат, метансульфонат, соль)	сигма	А5040-100г	Раствор для анестезии и эвтаназии
Наборы электродов Tweezertrodes (7 мм)	Гарвардский аппарат BTX	BTX 450165	Электроды пинцетного типа
Алюмосиликатные капилляры	Гарвардский аппарат	30-0108 (Английский
микроманипулятор	Нарисигэ	МА-153
микроскоп	Олимп	ЗС61
ECM Электро Квадратный Поратор	Гарвардский аппарат BTX	ЭБУ БТХ 830
Пластиковая ложка
губка
Верстак из пенополистирола

)