Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Abstract

Источник: Luukinen, H., et al. Моделирование туберкулеза у взрослых рыбок данио, инфицированных Mycobacterium marinum. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео описывает технику внутрибрюшинной инъекции, метод доставки растворов в брюшную полость взрослых рыбок данио

.

Protocol

1. Экспериментальное заражение M. marinum при внутрибрюшинном введении

1. Нанесите пипеткой каплю 5 мкл разбавленного бактериального раствора на кусок парапленочной пленки и втяните каплю в иглу инсулина 30 г.
2. Для эксперимента используйте рыб дикого типа в возрасте 5–8 месяцев и мутантных рыб rag1−/−hu1999. Обезболите взрослых рыбок данио в воде аквариума 0,02% этиловым эфиром 3-аминобензойной кислоты (pH 7,0). Расположите рыбу брюшной стороной вверх в щель на влажном вспененном пластике.
   Примечание: Рыбы-мутанты не способны подвергаться соматической рекомбинации и вырабатывать функциональные Т- и В-клетки.
3. Введите иглу между брюшными плавниками под углом примерно 45°. Держите отверстие иглы вверх, чтобы следить за тем, чтобы все отверстие находилось внутри брюшной полости. Медленно введите бактериальную суспензию и осторожно удалите иглу.
   заметка: В случае, если красный индикатор вытекает из рыбы при инъекции, исключите рыбу из эксперимента.
4. Сразу после инъекции пересадите рыб в восстановительный резервуар с пресной водой из аквариума.
5. Каждые 15 минут отбирайте образцы бактериальной суспензии на планшетах 7H10 из используемой бактериальной аликвоты и инкубируйте бактерии при температуре 29 °C в течение 5 дней, а затем проверяйте дозу инфекции, подсчитывая колонии на планшетах.
6. Регулярно проверяйте самочувствие рыб и усыпляйте всех рыб с симптомами инфекции с концентрацией этилового эфира 3-аминобензойной кислоты более 0,02% (pH 7,0).
   заметка: Примерно у 7% взрослых рыбок данио, инфицированных 34 ± 15 КОЕ, и у 30% рыбок данио, инфицированных 2029 ± 709 КОЕ, появятся симптомы к 8 неделям. Симптомы могут включать ненормальное плавание, отсутствие реакции на прикосновения, задыхание, отек или наблюдаемое истощение.
7. Ухаживайте за рыбками данио в соответствии с общепринятыми стандартами.

Materials

Mycobacterium marinum 	American Type Culture Collection 	ATCC 927
Phenol red	Sigma-Aldrich	P3532
Phosphate buffered saline tablets (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB
Middlebrock 7H10 agar	BD, Thermo Fisher Scientific	11799042
3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0)	Sigma-Aldrich	A5040
Omnican 100 30 G insulin needle	Braun	9151133
1 mL syringe	Henke Sass Wolf	4010.200V0