Микроинъекция эмбриона: техника доставки соединения в желток данио-рерио

Аннотация

Источник: Sorlien, E. L., et al. Эффективное производство и идентификация нокаутов генов, сгенерированных CRISPR/Cas9, в модельной системе Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео описывает технику микроинъекции эмбриона для доставки соединений в желточный мешок данио-рерио.

Протокол

1. Микроинъекции CRISPR-компонентов в эмбрионы рыбок данио-рерио

1. Установите резервуары для разведения в ночь перед инъекцией, поместив количество желаемых самцов и самок (обычно 2 самки и 1 или 2 самца) в аквариум для разведения с перегородкой.
2. Приготовьте микроинъекционную пластину с 1,5% агарозой в среде 1x E3 (см. Таблицу материалов) с 0,01% метиленового синего (фунгицида), налив 35 мл расплавленной агарозы в чашку Петри 10 см и аккуратно заложите в раствор пластиковую форму для создания клиновидных желобов, постукивая по форме для устранения пузырьков воздуха.
3. Дайте агарозе застыть и храните блюдо с небольшим количеством материала и завернутым в парафиновую пленку, чтобы предотвратить высыхание тарелки при температуре 4 °C.
   заметка: Инъекционные пластины можно использовать повторно в течение нескольких недель, пока лунки не деформируются или не высыхают, или пока на пластине не начнет расти плесень.
4. Утром в день инъекции разморозьте очищенную sgRNA и белок Cas9 на льду. Не забывайте работать со всеми материалами в перчатках, чтобы предотвратить загрязнение РНКазой, и используйте наконечники и трубки, не содержащие РНКазы.
5. Получите раствор для инъекций объемом 5 мкл путем объединения белка Cas9 и sgRNA в соотношении Cas9:sgRNA 2:1 для получения конечных концентраций 400 пг/нл белка Cas9 и 200 пг/нл sgРНК. Инкубируйте раствор Cas9/sgRNA при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы Cas9 и sgRNA образовали рибонуклеопротеиновый комплекс. Добавьте 0,5 мкл 2,5% масс./об. раствора фенолового красного цвета (см. Таблицу материалов) и воду, не содержащую РНКазы, до конечного объема 5 μл.<бр/> заметка: Было показано, что ионная сила раствора влияет на растворимость комплекса Cas9/sgRNA, поэтому добавление KCl может повысить эффективность разрезания sgRNA, которые демонстрируют низкое образование инделя.
6. Сделайте инъекционную иглу, потянув за стеклянный капилляр диаметром 1,0 мм с помощью съемника микропипетки. Обрежьте кончик свежеприготовленной иглы с помощью нового лезвия бритвы или щипцов, чтобы получить угловое отверстие, которое легко проткнет мешок с хорионом и желтком.
7. Поместите иглу в микроманипулятор, прикрепленный к микроинъектору с включенным источником воздуха. Под световым микроскопом, используя увеличение, подходящее для калибровки, определенной для конкретного аппарата, регулируйте давление впрыска до тех пор, пока игла не будет последовательно выбрасывать раствор объемом 1 нл в чашку Петри, заполненную минеральным маслом.
   заметка: Качество иглы имеет решающее значение. Потренируйтесь в изготовлении иглы и введении иглы в желточный мешок эмбрионов, пока этот навык не будет освоен, прежде чем приступать к дальнейшим экспериментам.
8. Снимите разделитель и дайте рыбе размножаться примерно 15 мин.<бр/> заметка: Более длительное время размножения приведет к получению большего количества эмбрионов, однако инъекция должна быть завершена, когда эмбрионы находятся на стадии 1 клетки, чтобы максимизировать вероятность того, что разрезание Cas9 произойдет раньше и, следовательно, уменьшить генетический мозаицизм. Эмбрионы могут быть введены на более поздних стадиях (2–4 клеточные стадии), но это может снизить скорость передачи модифицированного аллеля по зародышевой линии.
9. Соберите яйца с помощью ситечка и промойте их в чашке Петри диаметром 10 см с использованием 1x E3 media с 0,0001% метиленового синего. Изучите здоровье яиц под световым микроскопом, удаляя все неоплодотворенные яйца и мусор.
10. Отложите 10–15 эмбрионов в качестве неинъекционного контроля в отдельную чашку с маркировкой Петри.
11. С помощью передаточной пипетки аккуратно выровняйте яйца на подогретой до комнатной температуры инъекционной пластине.
12. Под диссекционным микроскопом при 2,5-кратном увеличении введите 1 нл раствора в желточный мешок каждого эмбриона, чтобы ввести в общей сложности 400 пг белка Cas9 и 200 пг sgRNA.
    заметка: Чтобы увеличить резку, если это желательно или необходимо, увеличьте конечную концентрацию белка Cas9 до 800 пг/нл и sgRNA до 400 пг/нл в растворе для инъекций; Однако это также может увеличить нецелевое срезание и/или ухудшить здоровье эмбриона. Эффективность резки также может быть увеличена путем впрыска непосредственно в ячейку. Тем не менее, впрыскивание в желточный мешок технически менее требовательно и дает достаточную нарезку для получения рыбы с высокой передачей зародышевой линии (>70% потомства, содержащего модифицированный аллель).
13. Верните введенные эмбрионы в правильно маркированную чашку Петри, накройте их 1x E3 средой с метиленовым синим и поместите в инкубатор для эмбрионов, установленный при температуре 28 °C.
14. Через 24 ч после оплодотворения (HPF) проверьте состояние введенных эмбрионов, удаляя мертвых или аномально развивающихся особей и меняя среду (см. Рисунок 1). Проверьте выживаемость по сравнению с неинъецированным контролем.
    заметка: При нацеливании на несущественный ген ожидается летальность менее 10% по сравнению с неинъекционным контролем. Если в популяциях, получавших инъекции, наблюдались повышенные уровни летальности по сравнению с контрольной группой, получавшей инъекцию, это может указывать на то, что ген-мишень имеет важное значение для развития, или побочные эффекты приводят к неудачному развитию. Может потребоваться уменьшение количества вводимых CRISPR-реагентов или получение новой sgРНК с уменьшенными нецелевыми эффектами.
15. Верните эмбрионы в инкубатор и продолжайте выращивание эмбрионов до 72 hpf, ежедневно меняя среду для поддержания здоровья эмбрионов.

Результаты

Рисунок 1: Сравнение состояния здоровья 24 эмбрионов, введенных HPF. Живой эмбрион (А), развившийся до 24 hpf, легко отличим от эмбриона, у которого было прервано развитие (В). Эмбрионы, которые похожи на (В) или имеют радикально измененные черты (А), такие как искривление позвоночника или измененное развитие головы и глаз, должны быть удалены из чашки

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Вода без РНКазы	Любой бренд		Синтез направляющих РНК. Термо<бр /> Фишер и Цяген оба кэрри<бр /> Подойдет вода.
Эмбриональные среды E3	Сделано на собственном предприятии		Среды для выращивания эмбрионов и изготовление injeciton plate. Рецепт: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449
Метиленовый синий	Сигма-Олдрич	М9140	Добавлен в 1x Е3 среду для предотвращения роста грибков на эмбрионах.
чашка Петри	Термо Фишер	FB0875711Z	Хранение эмбрионов, литая инъекционная пластина
агароза	Денвилл	СА3510-8	Литейная инъекционная пластина, агарозные гели.
Микроинсекционная форма	Инструменты адаптивной науки	ТУ-1	Для создания лунок для удержания эмбрионов во время закачки
Фенол красный	Сигма-Олдрич	П0290	Краситель для визуализации инъекций
нефтепродукт	Сигма-Олдрич	М5904-5МЛ	Для калибровки объема инъекции иглы.
Трансферные пипетки	Любой бренд		Перемещение эмбрионов
лезвие	Термо Фишер	11295-10	Разделка инъекционной иглой, обрезка хвоста взрослой рыбой.
инкубатор			Поддержание эмбрионов при температуре 28,5 С.
Съемник вертикулы для дозаторов	Инструменты Дэвида Копфа	700С	Генерация игл для инъекций. Дополнительные инструкции по вытягиванию иглы: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long
Капиллярные трубки	Инструменты Саттера	БФ100-58-10	Генерация игл для инъекций.
Советы по микрозагрузчикам	Эппендорф	930001007	Загрузите раствор в инъекционные иглы
Микроинъектор	Мировые прецизионные приборы	ПВ 820	Инъекция эмбрионов.
Диссекционный микроскоп	Лейка		Инъекция эмбрионов.
микроволновый	Любой бренд		Литейная инъекционная пластина, агарозные гели.
шкала	Любой бренд		Литейная инъекционная пластина, агарозные гели.
Перчатки	Любой бренд		По всем аспектам протокола.
N2	Любой бренд		Для выведения жидкости из капилляра для инъекции эмбриона
Стрип-пробирки для ПЦР	Любой бренд		По всем аспектам протокола.
Наконечники 200 μл	Любой бренд		По всем аспектам протокола.
Наконечники 10 μл	Любой бренд		По всем аспектам протокола.
Микропипетки	Любой бренд		По всем аспектам протокола.