Ксенотрансплантат, полученный от пациента из рыбок данио-рерио (zPDX): модель рака

Аннотация

Источник: Wang L. et al., Гетерогенная модель рака поджелудочной железы, полученная от пациента, с использованием личинок данио-рерио в качестве хозяев для сравнительной оценки лекарств. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео описывается техника создания модели ксенотрансплантата, полученной от пациента данио-рерио. В протоколе выборки мы оцениваем эффективность препаратов Гемцитабин и Навитоклакс на модели ксенотрансплантата опухоли поджелудочной железы.

Протокол

1. Введение суспензии смешанных клеток рыбке данио-рерио

1. Добавьте 10-кратный раствор трикаина в воду Е3 для обезболивания личинок данио-рерио и перенесите личинки (из шага 2.3) на инъекционную пластину, заполненную модифицированным Е3 (Е3 с 1 г/л глюкозы и 5 ммоль/л L-глютамина).
2. Залейте 25 мкл смешанной клеточной суспензии в иглу для микрокапилляров и введите иглу в манипулятор для микроинъекций.
3. Установите давление впрыска и время. Введите 50-80 клеток (~8 нл) в желточный мешок 48 hpf данио-рерио.

2. Культура ксенопривитой данио-рерио (модель zPDX)

1. Перенесите личинок данио-рерио после ксенотрансплантации в 40 мл смешанного раствора (раствор Е3 с 1 г/л глюкозы и 5 ммоль/л L-глутамина) при 32 °C.

3. Введение лекарств на ксенотрансплантированных рыбках данио-рерио и оценка жизнеспособности опухолевых клеток/фибробластов

1. Определение оптимальной концентрации гемцитабина/навитоклакса.
   1. Поместите 10 эмбрионов данио-рерио дикого типа при давлении 48 hpf в каждую лунку 12-луночной пластины.
   2. Добавьте в каждую лунку различные концентрации гемцитабина или навитоклакса и выдерживайте при температуре 32 °C в течение двух дней.
   3. Через 2 суток рассчитайте максимальную допустимую дозу (MTD) гемцитабина и навитоклакса, при которой личинки данио-рерио не проявляют значительных пороков развития и аномального поведения, а рабочие концентрации устанавливаются ниже MTD.
2. Лечение моделей zPDX гемцитабином/навитоклаксом.
   1. Поместите по 10 ксенопривитых личинок в каждую лунку 12-луночной пластины.
   2. Личинки разделили на четыре группы, обработали контрольную группу препаратом Е3, содержащим 0,1% ДМСО, а остальные группы обработали 5 г/мл гемцитабином и/или 50 мкМ навитоклаксом, и инкубировали при 32 °C в течение двух дней.
3. Оценка жизнеспособности и клеточного состава клеток в моделях zPDX.
   1. Обезболите ксенотрансплантированных личинок после обработки и поместите их в 3% метилцеллюлозу.
   2. Замагните личинки с бокового вида с помощью флуоресцентного микроскопа или конфокального микроскопа.
   3. Количественно оценивайте интенсивность красных и зеленых флуоресцентных сигналов с помощью программного обеспечения ImageJ и GraphPad.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
L-глютамин	GIBCO	21051024
Гемцитабин	Гемзан
Метилцеллюлоза	сигма	М0262
Навитоклакс(АБТ-263)	Селлек	С1001	Ингибитор Bcl-xL
оборудование
Микроинъектор	НАРИСИГЭ
Конфокальный микроскоп	LEICA	СП8	0.00