Вскрытие мозга рыбок данио-рерио: техника нейробиологии рыб

Аннотация

Источник: Lopez-Ramirez M. A. et al., Изоляция и культура нейросфер, полученных из мозга взрослых рыбок данио. J. Vis. Exp. (2016).

В этом видео описывается техника микровскрытия мозга взрослой рыбки данио. Этот метод помогает получить целые нейросферы мозга, которые могут быть изучены дальше.

Протокол

1. Вскрытие мозга взрослой рыбки данио

1. Подготовьте ложе для вскрытия, заполнив чашку Петри размером 100 мм x 15 мм пакетами со льдом. Затем накройте чашку Петри крышкой и выдерживайте при температуре -20 °C до тех пор, пока гель не замерзнет. Сверху на крышку положите квадрат чистой фильтровальной бумаги и оберните как фильтровальную бумагу, так и чашку Петри полиэтиленовой пленкой.
2. Очистите и простерилизуйте все инструменты для микродиссекции с помощью 70% этанола или нагревайте перед каждым использованием. Поместите все стерилизованные инструменты для вскрытия рядом с микроскопом для препарирования и непосредственно перед эвтаназией поместите ложе для вскрытия под микроскоп с оптоволоконной подсветкой.
3. Соберите 2 взрослых рыбок данио для подготовки нейросферы всего мозга и от 3 до 4 рыбок данио для создания нейросфер из рассеченных областей мозга.
4. Усыпьте взрослых рыбок данио (в возрасте 8-12 месяцев) в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по уходу за животными и их использованию. Далее погрузите рыбу в 75% этанол на 5-10 сек и быстро уложите в ложе для вскрытия с последующим обезглавливанием на уровне жабр с помощью хирургического лезвия.
   1. Чтобы усыпить животных, введите передозировку (300 мг/л) трикаина метансульфоната до тех пор, пока сердцебиение животного постепенно замедлится и кровообращение не остановится, затем погрузите в ледяную воду.
5. Поверните голову спинной стороной вниз, и с помощью ножниц сделайте продольный разрез от срезанной стороны ко рту. С помощью щипцов обнажают основание черепа и удаляют все прилегающие ткани. Разрежьте боковые стенки черепа от начала спинного мозга по направлению к тектуму.
6. С помощью ножниц разрежьте и удалите зрительные нервы, а затем удалите обе стороны самой боковой части черепа на уровне тектума. Поверните головку брюшной стороной вверх. С помощью щипцов отклеивают остальную часть самой апикальной части черепа.
7. Перенесите мозг вместе с оставшейся частью черепа в новую чашку со средой для препарирования (DMEM/F12 с пенициллином/стрептомицином). Очистите мозговую ткань в среде для препарирования с помощью пластиковой ручки микроножа, сохраняя все структуры мозга нетронутыми.
8. С этого момента продолжайте протокол, используя весь мозг рыбок данио.
   1. В качестве альтернативы можно адаптировать этот протокол к конкретным областям мозга для создания нейросфер из всего мозга рыбки данио или из конечного мозга, тектума/промежуточного мозга или мозжечка, рассеченных свежим скальпелем. Используйте нейронную специфическую флуоресцентную нейротрансгенную линию данио-рерио, чтобы препарировать интересующую область мозга в соответствии с рисунком 1.

Результаты

Рисунок 1: Дифференциация нейросфер мозга рыбок данио-рерио.(A-C, E) Фазово-контрастные изображения целых нейросфер мозга, культивируемых в среде Z-дифференцировки в течение 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) и 4 (C и D, DiVd4) дней. (E) Дорсальный вид всего мозга 12-месячной рыбки данио-рерио T...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM/F12 1x	Технологии Life	11330-032
Пенициллин-стрептомицин	Технологии Life	15140-122
Трикаин MS-222	сигма	А5040	стоковый раствор 4 мг/мл