Ортотопическая инъекция: имплантация тканеспецифических раковых клеток взрослой мыши

Аннотация

Источник: Katsuta, E., et al. создание мышиной ортотопической модели метастатического рака молочной железы и выполнение мышиной радикальной мастэктомии.J. Vis. Exp.(2018).

Видео демонстрирует технику ортотопической инокуляции рака молочной железы на мышиной модели. Этот метод обеспечивает высокую скорость онкогенеза с меньшей вариабельностью размера и формы опухоли по сравнению с подкожной или нехирургической инъекцией.

Протокол

1. Подготовка клеток (для 10 мышей)

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быть инокулированы в течение 1 часа после отделения от чашки, чтобы избежать снижения жизнеспособности клеток. В частности, клеточную суспензию следует смешивать со смесью студенистого белка в течение 15 мин после отделения клеток от чашки для поддержания их жизнеспособности.

1. Культивирование клеток 4T1-luc2, клеточной линии аденокарциномы молочной железы мыши, экспрессирующей люциферазу, в среде RPMI 1640 с 10% FBS в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5%_CO2.
2. Промойте адгезивные клетки 4T1-luc2 в 10-см посуде с фосфатно-соевым буфером (PBS) с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина с помощью пипетки P1000, а затем инкубируйте образец при 37 °C в течение 5 минут. Затем добавьте 4 мл питательной среды (RPMI-1640 с 10% FBS) с помощью серологической пипетки объемом 5 мл и перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл в вытяжке для культуры тканей. Центрифугируйте клеточную суспензию при давлении 180 x g в течение 5 мин.
3. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 2 мл PBS, затем подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
4. Суспензировать 2 x 10⁶ 4T1-luc2 клеток в 40 мкл холодного PBS (pH 7,4, 4 °C) в капюшоне для культуры тканей.
5. Смешайте клеточную суспензию объемом 40 мкл с 360 мкл смеси желатиновых белков в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл на льду в колпаке для культуры тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация составляет 1 x 10⁵/20 μL (1:9 PBS:смесь желатинового белка). Для ортотопической модели (без мастэктомии) использовали 1 x 10⁴/20 мкл от конечной концентрации, чтобы избежать достижения критериев эвтаназии (размер опухоли > 2 см) в течение двух недель.

2. Инокуляция раковых клеток

1. Поместите мышей в индукционную камеру для анестезии с потоком 2–4% изофлурана и 0,2 л/мин кислорода до тех пор, пока мыши не начнут спокойно дышать (2–3 минуты).
2. Возьмите мышь и введите 0,05 мг/кг бупренорфина ей подкожно в плечо.
3. Подтвердить адекватную анестезию можно отсутствием реакции на защемление пальца ноги. Вставьте нос мыши в отверстие маски для мыши, что позволяет проводить ингаляционную анестезию с потоком 2-4% изофлурана и 2 л/мин кислорода, прикрепленного к угольной канистре.
4. Зафиксируйте конечности мыши с помощью лабораторной ленты и простерилизуйте ее кожу с помощью хлоргексидина, йода и 75% этанола с помощью ватных палочек.
5. Сделайте разрез кожи диаметром 5 мм в середине передней стенки грудной клетки с помощью стерильных микродиссекционных ножниц, поднимите правую сторону кожи рядом с разрезом и отделите кожу от грудной стенки с помощью ножниц, а затем переверните кожу, чтобы обнажить правый жировой пакет молочной железы #2.
6. Осторожно введите 20 мкл суспензии раковых клеток с помощью инсулинового шприца объемом 1 мл с иглой 28,5 G в жировую подушку под прямым наблюдением через рану.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Игла проходит через рану, а не через кожу. Продолжайте удерживать иглу в жировой подушке в течение 5 секунд, прежде чем вытащить ее, чтобы дать время желатиновой белковой смеси застыть.
7. Закройте разрезы кожи швами, используя стерильные 5-0 нерассасывающиеся нити.
8. После операции верните животных в чистую клетку и наблюдайте за ними до тех пор, пока они не выздоровеют и не начнут свободно двигаться (через ~1–2 мин). Если животное не выглядит здоровым в течение 24 ч после операции, введите бупренорфин (0,2 мг/кг).
9. Снимите швы под наркозом (см. шаг 2.1) через 7 дней после операции.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ножницы для микродиссекции	Робоз	РС-5983	Для инокуляции раковых клеток и мастэктомии
5-0 шелковые шовные материалы	смотреть	774B F
Мемориальный институт Розуэлл-Парка 1640	Gibco	11875093	Для культивирования клеток
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	10437028	Для культивирования клеток
Трипсин-ЭДТА (0,25%)	Gibco	25200056	Для культивирования клеток
Сухой стерилизатор (Germinator 500)	Брейнтри Сайентиал	ГЕР 5287-120В	Для инокуляции раковых клеток и мастэктомии
Иглодержатель	Робоз	РС-7830	Для инокуляции раковых клеток и мастэктомии
Щипцы Адсона	Робоз	РС-5233	Для инокуляции раковых клеток и мастэктомии
клипер	Валь	9908-717	Для инокуляции раковых клеток и мастэктомии
Матригель	Корнинг	354234	Для иннокуляции раковых клеток