3D-кокультура с прямым взаимодействием: совместное культивирование раковых клеток с моноцитами для изучения их взаимодействия

Аннотация

Источник: Espinoza-Sánchez, et al. Анализ коммуникации между моноцитами и первичными клетками рака молочной железы в трехмерной системе на основе экстракта внеклеточного матрикса (ECME). J. Vis. Exp. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео описывает 3D совместное культивирование клеток рака молочной железы с моноцитами для изучения их взаимодействия в среде на основе экстракта внеклеточного матрикса (ECME). Этот метод помогает в изучении специфических особенностей, таких как деградация коллагена, набор иммунных клеток и клеточная инвазия.

Протокол

1. 3D сокультуры с прямым взаимодействием

1. Помечайте клетки и моноциты BrC различными флуоресцентными красителями перед культивированием клеток, чтобы обеспечить независимую сортировку каждой клеточной линии после культивирования для анализа экспрессии мРНК и белков. Используйте коммерчески доступные производные кумарина и родамина, которые свободно проходят через клеточную мембрану живых клеток. Общий протокол маркировки следующий:
   1. Приготовьте монослой интересующих клеток BrC (2 × 10,⁶ клеток в колбе с культурой 25^см2) и замените стандартную среду достаточным количеством предварительно подогретого рабочего раствора флуоресцентного красителя (1:2000 флуоресцентного красителя в стандартной базовой среде без какой-либо добавки). Инкубировать 30 минут при 37 °C во влажной среде с содержанием_CO2 5%. Отсадите раствор красителя и аккуратно смойте достаточным количеством 1x PBS. Отсадите PBS и добавьте стандартную среду.
   2. Трипсинизируйте монослой клетки 2 мл раствора 0,05% трипсина и 0,48 мМ ЭДТА в течение 5-10 мин при 37 °С. Добавьте 200 мкл FBS для остановки трипсинизации и 7 мл соответствующей среды без добавок. Ресуспендирование клеток с помощью пипетирования. Возьмите аликвоту объемом 10 мкл для подсчета клеток в камере Нейбауэра. Продолжайте использовать протокол совместного культивирования после подсчета клеток.
   3. Гранулируйте клетки в дозе 430 х г в течение 5 минут при ОТ (выполните это в первую очередь, так как моноциты растут в суспензии). Удалите надосадочную жидкость и аккуратно ресуспендируйте клетки 3 мл предварительно подогретого рабочего раствора флуоресцентного красителя (1:2000 флуоресцентного красителя в стандартной базовой среде без добавок). Инкубировать в течение 30 минут при 37 °C во влажной среде с содержанием_CO2 5%.
   4. Снова гранулируйте клетки, выбросьте рабочий раствор красителя и аккуратно восстановите суспендию 5-7 мл 1x PBS. Еще раз окатывайте, выбросьте PBS и повторно суспендируйте клетки в 5-7 мл стандартной среды. Возьмите аликвоту 10 мкл клеточной суспензии для подсчета клеток в камере Нейбауэра. Продолжайте использовать протокол совместного культивирования после подсчета клеток.
2. Установите сокультуру следующим образом: распределите достаточное количество ЭКМЭ на дно лунки, чтобы в каждой лунке образовался ровный слой 4-луночной камерной скользящей системы. Планшет 20 мкл одноклеточной суспензии, содержащей 5 ×^{10 5} меченых BrC клеток на лунку.
3. После 15-20 мин инкубации при 37 °C добавьте суспензию 2,5 x 10⁵ меченых моноцитов в среду для анализа объемом 80 мкл (с добавлением 60% ЭКМЭ).
4. Дайте ЭКМЭ застыть в течение 15-20 минут при 37 °C.
5. Добавьте 1 мл смеси клеток BrC и питательных сред моноцитов в соотношении 1:1.
6. Инкубируйте сокультуры при 37 °C во влажной среде с 5%_CO2 в течение 24 часов, 48 часов или 5 дней, чтобы отслеживать изменения в разные моменты времени.
7. Разрушайте белки ECM для восстановления клеток из культур. Отсадите и выбросьте среду, добавьте 0,5 мл 1x PBS с 0,1% трипсина и 0,25% ЭДТА и инкубируйте в течение 3 ч при 37 °C. После инкубации добавьте 0,5 мл 1x PBS с 10% FBS для нейтрализации трипсина и повторно суспендируйте клетки путем энергичного пипетирования для получения одноклеточной суспензии.
8. Гранулированные клетки при 765 x g в течение 5 мин при RT, отбрасывают надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в 5 мл 1x PBS с 10% FBS. Повторите этот шаг один раз.
9. Подвергните клеточную суспензию флуоресцентно-активируемой сортировке клеток (FACS) с помощью соответствующего инструмента. Убедитесь, что конечные популяции имеют чистоту не менее 95%).
10. После сортировки промыть клетки стерильным 1x PBS, гранулами (430 x g в течение 5 мин при RT) и повторно суспендировать в стерильный 1x PBS. Клетки могут быть обработаны в соответствии с определенными протоколами выделения РНК или анализа белка.
11. Повторите каждый анализ три раза, включая 3D-культуры каждой отдельной клеточной линии в качестве контроля.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
У937	Коллекция американской типовой культуры ATCC	ЦРЛ-1593.2	Моноцитарная клеточная линия/гистиоцитарная лимфома
ТГП-1	Коллекция американской типовой культуры ATCC	ТИБ-202	Моноцитарная клеточная линия/острый моноцитарный лейкоз
MCF-10A	Коллекция американской типовой культуры ATCC	КРЛ-10317	Нетрансформированная клеточная линия молочной железы
МКБ-7	Коллекция американской типовой культуры ATCC	ХТБ-22	Клеточная линия рака молочной железы
МДА-МБ-231	Коллекция американской типовой культуры ATCC	ХТБ-26	Клеточная линия рака молочной железы
RPMI 1640 средний	GIBCO BRL Life Technologies	11875-093
DMEM/F12	GIBCO BRL Life Technologies	11039-021
Антибиотик/антимикотик	GIBCO BRL Life Technologies	15240-062	100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл фунгизона
Фетальная бычья сыворотка	GIBCO BRL Life Technologies	16000-044
Сыворотка для лошадей	GIBCO BRL Life Technologies	16050114
0,05% Трипсин-ЭДТА 1X	GIBCO BRL Life Technologies	25300-062
PBS 1X (Фосфатно-солевой буфер	GIBCO BRL Life Technologies	20012-027
Эпидермальный фактор роста (EGF)	ПепроТех	АФ-100-15 (1,00мг)
инсулин	СИГМА-ОЛДРИЧ	И1882-100МГ
гидрокортизон	СИГМА-ОЛДРИЧ	H088-5G
Холерный токсин Vibrio cholerae	СИГМА-ОЛДРИЧ	К8052-1МГ
Матригель	Компания Corning Inc	356237	Саркома мышей Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), экстракт внеклеточного матрикса, хранить при -20°C до использования при 4°C
Предметное стекло камеры Lab-Tek с крышкой (8 лунок)	Нальге Нунк Интернэшнл	177402

гг.