zPDX-анализ инвазивности: исследование инвазивного поведения метастатических раковых клеток в ксенотрансплантатах эмбрионов данио-рерио

Аннотация

Источник: Ren, J. et al. Инвазивное поведение клеток рака молочной железы человека у эмбрионов рыбок данио. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео описывает метод микроинъекции для доставки клеток рака молочной железы в перивителлиновое пространство трансгенных эмбрионов рыбок данио. После инкубации мы визуализируем эмбрион под флуоресцентным микроскопом, чтобы наблюдать за инвазией, диссеминацией и метастазированием раковых клеток.

Протокол

1. Изображение и анализ метастатического процесса

1. Соберите несколько обезболенных эмбрионов с помощью пастеровской пипетки с широким наконечником и перенесите их на стеклянное дно полистирольной посуды.
2. Удалите лишнюю воду и оставьте ограниченное количество яичной воды. Манипулируйте эмбрионом с помощью инструмента для петли для волос и накройте стекло крышкой.
3. Используйте инвертированный конфокальный микроскоп в сочетании с погружными в воде или сухими объективами на большом расстоянии. Расположите эмбрион таким образом, чтобы интересующая область была как можно ближе к объекту.
4. Выполняйте визуализацию сразу после анестезии, чтобы снизить риск смерти из-за испарения жидкости.
   1. Улавливайте сигналы от меченых EGFP сосудистой сети и меченых mCherry опухолевых клеток в одном и том же положении на эмбрионах для совместной регистрации введенных клеток с кровеносными сосудами путем слияния двух каналов визуализации.
   2. Для каждого эмбриона данио-рерио соберите два разных набора изображений из области головы и хвоста.
5. Количественно определите количество диссеминированных клеток.
   1. Для инъекций перивителлинового пространства подсчитайте количество клеток у каждой рыбы, которые диссеминировались из клеточной массы в эмбриональное тело рыбы в области головы и хвоста 4,15; эти области находятся за границами сердечной полости фронтально, на вершине плавательного пузыря дорсально и за каудально урогенитальным отверстием.
   2. Для инъекции Doc подсчитайте количество отдельных клеток, которые проникли в коллагеновые волокна хвостового плавника из циркуляции (MDA-MB-231), или количество кластеров, образованных клетками коллективно (M2) в каудальной кроветворной ткани (CHT) каждой рыбки данио19.
6. Изучите инвазию и метастазирование более подробно с помощью конфокальной микроскопии (настоятельно рекомендуется).
   1. Используйте низкое увеличение (объектив 4X) для визуализации всего тела и получения обзора характера распространения опухолевых клеток.
      Примечание: Более высокое увеличение (объективы 20X и 40X) подходит для изучения внутри- и периопухолевого ангиогенеза и точной локализации диссеминированных клеток в теле эмбриона.
   2. Используйте лазер с длиной волны 488 нм для сканирования сосудистой сети эмбриона рыбки данио и лазер с длиной волны 543 нм для сканирования имплантированных опухолевых клеток, помеченных красной флуоресценцией. Получите высококачественное изображение, сканируя каждый эмбрион в восемь-десять этапов. Сканируйте и усредняйте каждый шаг шесть раз.
7. Осторожно поместите зародыш обратно в воду для яиц, если это требуется для дальнейших экспериментов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Пипетка Пастера с широким наконечником (0,5-20 мкл)	Эппендорф	F276456I
Конфокальный микроскоп	Лейка	SP5 ШТЭД
Стереомикроскоп	Лейка	МЗ16ФА
Tg (fli:EGFP) штамм данио-рерио			Любезно предоставлено доктором Евой Снаар Ягальской (Институт биологии, Лейденский университет, Лейден, Нидерланды)
Посуда из полистирола со стеклянным дном	WillCo	ГВСТ-5040
Флуоресцентный стереомикроскоп	Лейка	М165 ФК
Трикаин (3-аминобензойная кислота)	СигмаОлдрич	А-5040