$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Децеллюляризация
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура была адаптирована из ранее опубликованных методов, ориентированных на децеллюляризацию жировой ткани, которые включали ионное детергентное средство дезоксихолата натрия, а не додецилсульфат натрия для эффективного удаления ДНК.
- В 1-й день снимите замороженные жировые прокладки или МФУ с температурой -80 °C и разморозьте при комнатной температуре.
- После оттаивания кратковременно высушите МФУ на деликатной рабочей салфетке. Взвесьте МФУ с помощью аналитических весов.
- С помощью щипцов с ножницами или скальпелем разделите ткань на образцы размером 3 мм x 3 мм x 3 мм для исследования неповрежденного ECM и оставшейся ткани для производства гидрогеля><.
заметка: Количество образцов зависит от количества методов тестирования, например, ниже описан сбор двух образцов: один для заделки парафина (шаг 1.5) и один для замораживания в криостатной среде для заделки, если это необходимо (см. Таблицу материалов и шаг 1.6).
- Взвесьте ткани. При заделке в парафин для сруба перейдите к шагу 1.5. При замораживании в криостате закладной среды для разреза перейдите к шагу 1.6.
- В химическом колпаке погрузите ткань в 10% нейтральный буферизованный формалин (NBF) (см. Таблицу материалов) на 24 часа при 4 °C. Промойте 3 раза в PBS по 5 минут каждый. Погрузите ткань в 30% сахарозу на 48 часов при температуре 4 °C.
- Взвесьте ткань теперь, когда этот кусок был удален. Перейдите к шагу 1.6.
- Поместите детали МФУ в химическую вытяжку в кассету с маркировкой, подготовленную криостатной средой для встраивания. Добавьте еще криостатную среду для встраивания, чтобы покрыть ткань.
- Поместите кассету в стакан с 2-метилбутаном (см. Таблицу материалов), который предварительно охлаждается жидким азотом. В стакане должно быть достаточно 2-метилбутана, чтобы покрыть дно, но недостаточно для погружения кассеты, потому что закладочная среда криостата не должна касаться 2-метилбутана. Дайте кассете постоять в 2-метилбутане до тех пор, пока среда для встраивания криостата не замерзнет и не станет непрозрачной.
- Заверните кассету (кассеты) в фольгу, наклейте этикетку и оставьте при температуре -80 °C до тех пор, пока она не будет использована для секционирования.
заметка: Ткани, помещенные непосредственно в среду для встраивания криостата, были срезаны с температурой 5 мкм, в то время как ткани, инкубированные в сахарозе, были срезаны с точностью до 30 мкм для сохранения морфологии адипоцитов.
- С помощью щипцов вручную массируйте оставшиеся ткани.
заметка: Кусочки салфетки также могут быть помещены в 10% NBF на 24–48 часов, промыты в PBS и оставлены в 70% этаноле до погружения в парафин. После встраивания можно использовать срезы размером 5 мкм для окрашивания гематоксилином и эозином (H & E) (см. раздел 2 ниже).
- Поместите МФУ в посуду по 6 см с 5 мл 0,02% трипсина/0,05% раствора ЭДТА. Выдерживать при 37 °C в течение 1 ч. Распылите и протрите посуду 70% этанолом перед помещением в инкубатор.
- Используйте фильтры 0,7 мм для промывки МФУ деионизированной (DI) водой, трижды вылив воду на ткань. Используйте щипцы для ручного массажа ткани между мытьем.
- Коротко просушите ткань на деликатной работе, протрите и взвесьте. Поместите салфетки в предварительно автоклавный стакан, содержащий мешалку соответствующего размера. Насыпьте салфетки 60 мл 3% t-октилфеноксиполиэтоксиэтанола (см. Таблицу материалов) на 1 г ткани и перемешивайте в течение 1 ч при комнатной температуре. Используйте минимум 20 мл.
- Слейте салфетку и содержимое в ситечко. Промойте стакан водой DI и вылейте на салфетки. Повторите еще два раза. Используйте щипцы для ручного массажа ткани между полосканиями.
- Коротко просушите ткань на деликатной работе, протрите и взвесьте. Поместите салфетки и перемешайте батончики обратно в те же стаканы, и залейте 60 мл 4% дезоксихолевой кислоты на 1 г ткани. Перемешивайте в течение 1 часа при комнатной температуре. Используйте минимум 20 мл.
- Слейте салфетку и содержимое в сетчатое ситечко. Промойте стакан водой DI и вылейте на салфетки. Повторите еще два раза. Используйте щипцы для ручного массажа ткани между полосканиями.
- Коротко просушите ткань на деликатной работе, протрите и взвесьте.
- Поместите салфетки в тот же стакан с пресной деионизированной водой с добавлением 1% пенициллин-стрептомицина. Плотно накрываем парафиновой пленкой. Оставьте на ночь при температуре 4 °C.
- Вымойте ситечки и стаканы для использования на следующий день.
- На 2-й день слейте содержимое стакана в ситечко. Коротко просушите ткань на деликатной работе, протрите и взвесьте.
- Поместите МФУ в одну и ту же мензурку с мешалкой соответствующего размера. Налейте 60 мл 4% раствора этанола/0,1% надуксусной кислоты на 1 г ткани. Используйте минимум 20 мл. Перемешивайте в течение 2 часов при комнатной температуре.
- Слейте салфетку и содержимое в ситечко толщиной 0,7 мм. С помощью щипцов вручную массируйте ткани. Поместите содержимое обратно в стакан. Промойте салфетку, накрыв ее 60 мл 1x PBS на 1 г салфетки. Используйте минимум 20 мл. Перемешивайте 15 минут при комнатной температуре. Повторите один раз.
- Слейте салфетку и содержимое в ситечко толщиной 0,7 мм. С помощью щипцов вручную массируйте ткани. Переложите содержимое обратно в стакан. Промойте салфетку, покрыв ее 60 мл деионизированной воды на 1 г салфетки. Используйте минимум 20 мл. Перемешивайте 15 минут при комнатной температуре. Повторите один раз.
- Коротко просушите ткань на деликатной работе, протрите и взвесьте. Слейте салфетку и содержимое в ситечко. С помощью щипцов вручную массируйте ткани.
- Переложите содержимое обратно в стакан. Покройте ткани 60 мл 100% н-пропанола на 1 г ткани. Используйте минимум 20 мл. Перемешивайте в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Коротко просушите ткань на деликатной работе, протрите и взвесьте. Слейте салфетку и содержимое в ситечко толщиной 0,7 мм. С помощью щипцов вручную массируйте ткани.
- Переложите содержимое обратно в стакан. Промойте салфетку, покрыв ее 60 мл деионизированной воды на 1 г салфетки. Используйте минимум 20 мл. Перемешивайте 15 минут при комнатной температуре. Повторите три раза.
- Слейте салфетку и содержимое в ситечко. Повторите шаги 2.3–2.6 для сбора кусочков ткани для инкубации сахарозы и замораживания в среде для закладки криостата.
- Коротко просушите ткань на деликатной работе, протрите и взвесьте. Поместите в пробирку объемом 15 мл с маркировкой. Заморозьте до -80 °C на ночь.