Эскалация дозы: метод развития лекарственной устойчивости в раковых клетках

Аннотация

Источник: Yamaoka T. et al., Создание и характеристика трех устойчивых к афатинибу клеточных линий аденокарциномы легкого PC-9, разработанных с увеличением доз афатиниба. J. Vis. Exp., 2019

Видео описывает развитие лекарственной устойчивости у раковых клеток путем воздействия на клетки возрастающих доз лекарства после вычисления значений IC₅₀ препарата ранее с помощью анализа MTT. Протокол примера описывает пошаговый процесс разработки лекарственно-устойчивых клеток.

Протокол

1. Создание трех независимых афатиниб-резистентных клеточных линий PC-9

1. Определение исходной концентрации воздействия афатиниба на клетки PC-9 с помощью анализа 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ).
   1. Культивирование клеток PC-9 в питательной среде, содержащей фетальную бычью сыворотку (10%), пенициллин (100 ЕД/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл) в обработанной клеточной культурой 10-сантиметровой чашке в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 при 37 °C.
   2. Ресуспендируйте клетки PC-9 в концентрации 4 x 10 4 клеток/мл в питательной среде, а затем затравите в дозе 50 мкл/лунку в 96-луночном микропланшете. Конечная концентрация клеток составляет 2,0 x 10³ клеток/50 μл/лунка. Инкубируйте в течение ночи в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 при температуре 37°C.
   3. Добавьте 50 мкл раствора афатиниба в различных концентрациях: 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 и 20 мкМ в лунки, содержащие питательную среду (50 мкл). Конечный объем и концентрации афатиниба составляют 100 мкл и 0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 и 10 мкМ соответственно.
   4. Инкубируйте 96-луночный планшет в течение 96 часов в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 при температуре 37 °C.
   5. Добавьте 15 мкл раствора красителя (см. Таблицу материалов) в каждую лунку и инкубируйте в течение 4 ч в инкубаторе с 5%_CO2 при 37 °C, а затем добавьте 100 μL раствора для солюбизации/стоп-раствора (см. Таблицу материалов) в каждую лунку и инкубируйте в течение ночи в инкубаторе с 5%_CO2 при 37 °C.
   6. Измерьте оптическую плотность на длине волны 570 нм (наружный диаметр₅₇₀) с помощью считывателя микропланшетов (см. Таблицу материалов). Подготовьте 6-12 повторов и повторите опыты не менее трех раз.
   7. Используйте статистическое программное обеспечение (см. Таблицу материалов), чтобы графически изобразить эти данные в виде полулогарифмического графика и рассчитать значение IC₅₀, которое представляет собой концентрацию препарата, снижающую реакцию до 50% от ее максимальной (см. Таблицу материалов).
2. Непрерывное воздействие на клетки PC-9 необратимого EGFR-TKI, афатиниба, путем ступенчатого повышения дозы в трех независимых 10-сантиметровых чашках
   1. Культивировать клетки PC-9 в чашках p100, содержащих 10 мл питательной среды. Когда клетки PC-9 достигнут субконфлюентной стадии, перенесите 1 мл клеточной суспензии в три новые чашки p100 с 9 мл питательной среды. Разбавленные клетки PC-9 в соотношении 1:10 становятся субконфлюентными через 3-4 дня, при этом количество клеток составляет примерно 4-5 x 10⁵ клеток/мл.
   2. На следующий день добавьте 1/10 от значения IC₅₀ афатиниба в каждую из трех тарелок p100.
      Примечание: Афатиниб восстанавливают в ДМСО при исходных концентрациях 1 мкМ, 10 мкМ, 100 мкМ, 1 мМ и 5 мМ. От 1 до 10 мкл раствора афатиниба добавляют в 10 мл питательной среды в культуре в соответствии с требуемыми конечными концентрациями.
   3. Когда клетки в чашках p100, содержащих афатиниб, становятся субсливающимися, хорошо перемешайте с помощью аспирации с помощью пипетки объемом 1 мл и добавьте 1 мл клеточной суспензии к 9 мл свежей питательной среды в новой чашке p100. Далее добавьте в новую культуру на 10-20% более высокие концентрации афатиниба.
   4. Увеличивают концентрацию афатиниба от 0,1 нМ до 1 мкМ в среде путем ступенчатого нарастания дозы с увеличением концентрации афатиниба на 10-20% на каждом этапе в течение 10-12 месяцев.
      заметка: Когда концентрация афатиниба приближается к значению IC₅₀, рост клеток становится довольно медленным. Если клетки разделены в соотношении 1:9, они могут не расти, так как эти клетки погибают от более высоких концентраций афатиниба. Таким образом, при более высоких концентрациях афанитиба клетки могут быть разделены в соотношении 1:2. Наиболее резистентные клетки выращивали в среде, содержащей афатиниб, в течение 3-14 дней, и среду не меняли до тех пор, пока резистентные клетки не проходили.
   5. Культивировать афатиниб-резистентные клетки в течение 2-3 месяцев в 1 мкМ афатиниб-содержащей питательной среде. При концентрации афатиниба 1 мкМ требуется 10-12 месяцев для развития резистентности к афатинибу в этой модели. Проведите анализ МТТ, чтобы подтвердить, что клетки устойчивы к афатинибу. Три независимо установленные клеточные линии устойчивости к афатинибу были названы AFR1, AFR2 и AFR3.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ФБС	ГИБКО	26140-079
Стрептококк	ГИБКО	15140-163
Обработанная клеточной культурой посуда 10 см	Виоламо	2-8590-03 (Английский)
Афатиниб	Селлек	С1011
96 луночный микропланшет	термо	130188
CellTiter 96	Компания Promega	Г4100	Анализ пролиферации нерадиоактивных клеток; Раствор красителя и раствор Solubilization/Stop
Спектрофотометр NanoDrop Lite	термо	NA	спектрофотометр
Программное обеспечение GraphPad Prism v.7	ГрафПад, Инк.	NA	статистическое программное обеспечение
Дмсо	Вако	043-07216 (Английский