Анализ колониеобразования: оценка эффективности противоопухолевых препаратов на колониеобразующих клетках рака легких

Аннотация

Источник: Lee, J. Y.et al, Доклиническая оценка биологической активности противоопухолевого кумарина OT48 с помощью сфероидов, анализов формирования колоний и ксенотрансплантатов данио-рерио.J. Vis. Exp. (2018).

Это видео описывает анализ формирования колоний, который помогает определить способность клеток рака легких размножаться бесконечно и образовывать отдельные колонии. Мы можем проанализировать влияние противоопухолевого агента на колониеобразующие клетки, анализируя изменения в количестве и/или размере образующихся колоний.

Протокол

1. Анализ колониеобразования

1. Культивирование клеток А549 в концентрации 20 000 клеток/^см2 в 15 мл RPMI1640 среды для культивирования клеток с добавлением 10% FBS (фетальной сыворотки крупного рогатого скота) и 1% антибиотиков в колбе 75^см2 в инкубаторе с СО2 при 37 °С и 5%_СО2.
2. В день эксперимента определите концентрацию клеток с помощью гемоцитометра. Соберите 50 000 клеток путем центрифугирования при 400 x g в течение 7 мин в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл и повторно суспензируйте клетки в 100 мкл 1x стерильного PBS (фосфатно-солевого буфера) в пробирках объемом 1,5 мл.
3. Дозируйте 1,1 мл полутвердой среды на основе метилцеллюлозы (MCBM) в пробирках объемом 15 мл с помощью мультипипетки. Подготовьте по одной пробирке для каждого условия.
4. Добавьте 110 мкл FBS к 1,1 мл MCBM с помощью микропипетки P200.
5. Засеивает клетки в концентрации 1 000 клеток/мл. Соберите 2,4 мкл клеточной суспензии из исходного раствора (50 000 клеток в 100 мкл 1x PBS) с помощью микропипетки P2 и добавьте к 1,1 мл MCBM с добавлением 10% FBS.
6. После добавления ячеек сделайте вихревые трубки в течение 1 минуты, удерживая их вертикально с максимальной скоростью, чтобы хорошо перемешать MCBM и ячейки.
7. Добавьте тестовые соединения (OT48 отдельно или в комбинации с A1210477). Подготовьте отдельную пробирку в качестве контроля для используемого растворителя (в данном случае диметилсульфоксида (ДМСО)). В зависимости от концентрации соединений и объема, добавляемого для каждого условия, контроль растворителя будет включать наивысшую концентрацию растворителя, используемого для разведения испытуемого соединения, для оценки побочных эффектов, вызванных растворителем.
8. Вихревые трубки в течение 1 минуты.
9. Для каждого анализа добавляйте 1 мл смеси с помощью микропипетки P1000 в центральную лунку 12-луночного планшета для культивирования клеток.
10. Наполните пустые лунки 1 мл стерильной воды или 1x PBS для стабилизации влажности.
11. Инкубировать культуральные планшеты в течение 10 дней в инкубаторе при температуре 37 °C и 5%_CO2
12. После 10 дней инкубации добавьте 200 мкл исходного раствора MTT (метилтиазолилдифенил-тетразолия бромид) (5 мг/мл) в каждую лунку до достижения конечной концентрации 1 мг/мл.
13. Инкубировать 10 мин в инкубаторе при температуре 37 °C и 5%_CO2. Жизнеспособные колонии станут фиолетовыми.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
А549	АТКС	ВКЛ-185	37 С°
РПМИ 1640	Лонза	30096 (Английский	4 С°
ФБС	Биозапад	С1520-500	-20 С°
Пенициллин-стрептомицин	Лонза	17-602Э	-20 С°
Колба для клеточных культур T75	уровень звукового давления	70075	РТ
Решение PBS	Гиклон	SH30256.02	РТ
Туба 1,5 мл	Экстраген	Трубка-170-С	РТ
Туба 15 мл	Хендай Микро	H20015	РТ
12-луночная пластина	уровень звукового давления	30012	РТ
МетоКульт	Технологии стволовых клеток	4230	-20 С°
Тиазолил синий бромид тетразолия (порошок МТТ)	сигма	М5622	4 С°
LAS4000	GE Технологии в здравоохранении		РТ

)