Ксенотрансплантат данио-рерио: метод оценки противораковой эффективности терапии на онкогенность у рыбок данио in vivo

Аннотация

Источник: Lee, J. Y et al.,Доклиническая оценка биологической активности противоопухолевого кумарина OT48 с помощью сфероидов, анализов формирования колоний и ксенотрансплантатов данио-рерио.J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео описывается анализ ксенотрансплантата данио-рерио для оценки образования опухолей in vivo и изучения эффекта терапевтических агентов.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Анализ ксенотрансплантата данио-рерио

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот технический подход визуализируется в виде схемы (Рисунок 1).

1. Приготовление стоковых реагентов
   1. Приготовьте 1 л 30-кратного раствора Данио: 1740 мМ NaCl, 21 мМ KCl, 12 мМ MgSO₄•7H2O, 18 мМ Ca(NO₃)₂ и 150 мМ HEPES. Отрегулируйте pH буфера до 7,6 с помощью pH-метра.
   2. Приготовьте 1% (50x) раствор трикаина: растворите 20 мг этил3-аминобензоата метансульфоната (трикаина) в 2 мл дистиллированной воды.
   3. Приготовьте 1% раствор фенола Red-PBS: Добавьте 2 мкл раствора натриевой соли Phenol Red к 198 мкл стерилизованного раствора PBS в пробирке объемом 1,5 мкл.
   4. Приготовьте 3% метилцеллюлозу: Добавьте 3 г метилцеллюлозы в 100 мл 1x раствора Данио.
2. Яйценоскость и инкубация данио-рерио
   1. Разделите одну самку и одного самца данио-рерио в перегородке, наполненной стерилизованной ультрафиолетовым излучением и отфильтрованной водопроводной водой при температуре 28,5 °C в темноте. Через 24 часа после разлучения смешайте рыб обоих полов, чтобы начать спаривание. Оплодотворенные яйца переложите из брачного резервуара в чашку Петри, содержащую 5 мл свежего раствора Дано.
   2. Яйца трижды промыть 5 мл раствора Данио. Для промывки тщательно отсасывайте яйца с помощью пипетки и переложите до 5 мл свежего раствора. Выдерживать в течение 8 ч при температуре 28,5 °C.
      1. После 8 ч инкубации в растворе Дано замените на раствор Дано, содержащий 0,03% 1-фенил-2-тиомочевину (ПТУ) для подавления пигментации. Отсортируйте непрозрачные яйцеклетки (неоплодотворенные или содержащие неразвитые эмбрионы), чтобы предотвратить заражение.
3. Дехорионация эмбрионов
   1. Через 24 ч после оплодотворения (HPF) дехорионат эмбрионов данио-рерио с помощью острых щипцов. Инкубируйте инкубационные эмбрионы в растворе Данио с 0,03% PTU при 28,5 °C до 48 hpf.
4. Препарат клеток, обработанных соединением
   1. Засейте клетки А549 при 20 000 клеток/^см2 в 25 см² культуральных колбы. После 24 ч посева добавить компаунды (в данном случае OT48 при 50 мкМ и/или A1210477 при 20 мкМ) в течение 24 ч в инкубаторе при 37 °C и 5%_CO2.
   2. Установите время обработки для каждого соединения, чтобы поддерживать жизнеспособность клеток, но при этом направлять их к гибели клеток. Этот временной момент должен быть индивидуально настроен на основе жизнеспособности клеток, морфологии и молекулярных маркеров.
   3. За 2 ч до окончания лечения окрашивают клетки 4 мкМ флуоресцентного клеточного трекера красителем CM-Dil при 37 °C и 5%_CO2. Через 2 ч инкубации трипсинизируйте клетки 0,05% трипсин-ЭДТА и разведите 106 клеток в 50 мкл фенолового раствора Red-PBS перед инъекцией.
5. Микроинъекция раковых клеток для формирования ксенотрансплантата
   1. Обезболить рыбок данио в 0,02% растворе трикаина в течение 5 минут, пока они не осядут на агаровой пластине.
   2. Потяните стеклянный капилляр диаметром 1,0 мм (наружный диаметр (OD)) с помощью съемника микропипетки (Настройки программы: P: 300, Нагрев: 260, Вытягивание: 60, VEL: 50 и Время: 200). Разрежьте микрокапилляр шприцем до получения острого края. Нагрузите микрокапилляры 20 μл клеточного/фенольного раствора Red-PBS. Установите давление впрыска и время подачи 2 нл на впрыск.
   3. Введите 100–200 клеток в желточный мешок, введя от 6 до 10 нл через 3–5 инъекций. После инъекции дайте рыбе восстановиться в течение 10-30 минут в 5 мл свежего раствора Дано, содержащего раствор ПТУ. Отгрузите рыбу в 24-луночные планшеты с 1 мл раствора Дано, содержащего раствор ПТЕ, и инкубируйте в течение 72 ч при температуре 28,5 °C.
   4. Через 72 ч инкубации обезболить рыб в 0,02% растворе трикаина и обездвижить на предметном стекле каплей 3% метилцеллюлозы. Сделайте 5-кратные снимки с помощью флуоресцентной микроскопии на длине волны от 620 до 750 нм.
   5. Количественное определение размера флуоресцентных опухолей с помощью программного обеспечения ImageJ. Выберите меню "Анализ | Мера». Сохраняйте значения, соответствующие флуоресцентному сигналу, и анализируйте их с помощью статистического программного обеспечения для графического представления.

Результаты

Рисунок 1: Принципиальная схема общего процесса анализа ксенотрансплантата у рыбок данио.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
А549	АТКС	ВКЛ-185	37 С°
РПМИ 1640	Лонза	30096 (Английский	4 С°
ФБС	Биозапад	С1520-500	-20 С°
Пенициллин-стрептомицин	Лонза	17-602Э	-20 С°
Колба для клеточных культур T25	уровень звукового давления	70025	РТ
Колба для клеточных культур T75	уровень звукового давления	70075	РТ
Колба для клеточных культур T175	уровень звукового давления	71175	РТ
Туба 1,5 мл	Экстраген	Трубка-170-С	РТ
24-луночный планшет	уровень звукового давления	30024	РТ
Петридиш	уровень звукового давления	10100	РТ
Решение PBS	Гиклон	SH30256.02	РТ
Трипсин-ЭДТА	Gibco	Тел.: 25-300-054	4 С°
Хлорид натрия	Сигма-Олдрич	71382	РТ
Хлорид калия (KCL)	Сигма-Олдрич	П9541	РТ
Гептагидрат сульфата магния (MgSO4.7H2O)	Сигма-Олдрич	М2773	РТ
Тетрагидрат нитрата кальция (Ca(NO3)2)	Сигма-Олдрич	С1396 г	РТ
Решение HEPES	Сигма-Олдрич	Н0887	РТ
Этил3-аминобензоат метансульфонат (трикаин)	Сигма-Олдрич	Е10521	РТ
Раствор фенолового красного	Сигма-Олдрич	П0290	РТ
Метилцеллюлоза	Сигма-Олдрич	М0512	РТ
1-фенил-2-тиомочевина (ПТУ)	Сигма-Олдрич	П7629	РТ
Краситель CM-Dil	Инвитроген	С7001	-20 С°
Стеклянный капилляр	Мировые прецизионные приборы	TW 100F-4	РТ
Съемник микропипеток	Инструмент затвора, США	-97	РТ
Микроинжектор	Мировые прецизионные приборы	ПВ820	РТ
шприц	КОВАКС	1мл	РТ
Микрозагрузчик	Эппендорф	5242956003	РТ
Предметное стекло	Мариенфельд	ХСУ-1000612	РТ
Флуоресцентная микроскопия	Лейка	DE/DM 5000B	РТ

) шт. .