Анализ фототоксичности in vitro: метод оценки фототоксического потенциала фотосенсибилизатора в клетках рака легкого на основе ФДТ

Аннотация

Источник: Chang, J. E., et al. Противоопухолевая эффективность фотодинамической терапии наночастицами, нацеленными на рак легких.J. Vis. Exp.(2016).

Фотодинамическая терапия (ФДТ) - это неинвазивный и нехирургический метод лечения рака легких. Фотосенсибилизаторы избирательно накапливаются в опухолевой ткани и приводят к гибели опухолевых клеток в присутствии кислорода и соответствующей длины волны света. В этом видео протокола метод на основе ФДТ используется для оценки фототоксического потенциала потенциального фотосенсибилизатора в клетках рака легких.

Протокол

1. Синтез гиалуроновой кислоты-керамида (HACE)

1. Солюбилизируйте 12,21 ммоль олигомера гиалуроновой кислоты (ГК) и 9,77 ммоль гидроксида тетра-н-бутиламмония (ТБК) в 60 мл дважды дистиллированной воды (ДДВ). Помешивайте 30 минут.
2. Для синтеза линкера DS-Y30 необходимо растворить 8,59 ммоль керамида DS-Y30 и 9,45 ммоль триэтиламина в 25 мл тетрагидрофурана (ТГФ). Смешать с 8,59 ммолью 4-хлорметилбензоила хлорида в ТГФ. Перемешивайте в течение 6 часов при температуре 60 °C.
3. Синтезированные 8,10 ммоль HA-TBA и 0,41 ммоль линкера DS-Y30 растворить в смеси ТГФ и ацетонитрила (4:1, v/v). Перемешивайте в течение 5 часов при 40 °C.
4. Удалите загрязнения путем фильтрации с помощью фильтрующего агента и удалите органический растворитель путем вакуумного испарения. Очистите продукт с помощью диализной мембраны (отсечка по молекулярной массе: 3,5 кДа) и лиофилизируйте.

2. Получение наночастиц

1. Растворите 1 мг HB и 1 мг паклитаксела в 0,5 мл диметилсульфоксида (ДМСО) и смешайте с 0,5 мл DDW путем вихревого перемешивания в течение 5 минут. Затем растворите HACE в этой смеси путем вихревого перемешивания в течение еще 5 минут.
2. Чтобы удалить растворитель, нагрейте до 70 °C в течение 4 часов под слабой струей газообразного азота.
3. Повторно суспендируйте пленку, состоящую из HACE, HB и паклитаксела, с 1 мл DDW. Фильтр с помощью шприцевого фильтра (размер пор 0,45 мкм) для удаления некапсулированных препаратов.

3. Фототоксичность in vitro

1. Поглощение наночастиц в клеточных линиях рака легкого
   1. Готовят среду RPMI-1640, содержащую 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки и 1% (w/v) пенициллин-стрептомицин.
   2. Засейте клетки А549 в 24-луночные клеточные культуральные планшеты с плотностью 1 × 10 5 клеток/лунку (тройные для каждой группы). Инкубировать в течение 24 часов при 37 °C во влажной атмосфере с содержанием_CO2 5% и 95% воздуха.
   3. После прикрепления клеток удалите среду и промойте клетки, добавив 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
   4. Растворите наночастицы в PBS до конечной концентрации 2 мкМ/мл HB. Затем инкубируйте клетки с 1 мл PBS, пустыми NP, HB-NP или HB-P-NP в каждой лунке в течение 4 часов в темноте.
   5. Удалите весь раствор и промойте клетки, добавив 1 мл холодного PBS. Повторите этап стирки еще раз. Добавьте свежую питательную среду.
2. Анализ жизнеспособности клеток
   1. Поместите клеточную культуральную пластину под волокно PDT (с расстоянием 1 см от волокна PDT до лунки). Наденьте лазерные защитные очки и освещайте ячейки лазером PDT (630 нм, 400 мВт/^см2) в темноте в течение различных периодов времени: 0, 5, 10, 20, 30 и 40 сек (0, 2, 4, 8, 12 и 16 Дж/^см2). Затем инкубируйте клетки в течение 24 часов в темноте.
   2. Отсадите среду и промойте клетки, добавив 1 мл холодной PBS. Повторите этап стирки еще раз.
   3. Добавьте в каждую лунку по 10 мкл раствора для измерения цитотоксичности. Инкубировать в темноте в течение 2 часов.
   4. Измерьте поглощение на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Олиго гиалуроновая кислота	Биоленд Ко., Лтд.
DS-Y30 (керамид 3B; в основном нолеоилфитосфингозин)	Doosan Biotech Co., Ltd.
дигидразид адипиновой кислоты	Сигма Олдрич	А0638
N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид	Сигма Олдрич	No 39391
4-(хлорметил)бензоилхлорид	Сигма Олдрич	270784
Паклитаксел	Корпорации Тайхуа
Шприцевой фильтр	Сарториус Стедим Биотех ГмбХ	17762	15 мм, RC, PP, 0,45 мкм
РПМИ-1640	Гибко Лайф Текнолоджис, Инк.	11875
Пенициллин–стрептомицин	Гибко Лайф Текнолоджис, Инк.	15070
Фетальная бычья сыворотка	Гибко Лайф Текнолоджис, Инк.	16140071
Celite (Фильтрующий агент)	Сигма Олдрич	No 6858	Смотрите шаг 1.4

г. г.