$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Синтез гиалуроновой кислоты-керамида (HACE)
- Солюбилизируйте 12,21 ммоль олигомера гиалуроновой кислоты (ГК) и 9,77 ммоль гидроксида тетра-н-бутиламмония (ТБК) в 60 мл дважды дистиллированной воды (ДДВ). Помешивайте 30 минут.
- Для синтеза линкера DS-Y30 необходимо растворить 8,59 ммоль керамида DS-Y30 и 9,45 ммоль триэтиламина в 25 мл тетрагидрофурана (ТГФ). Смешать с 8,59 ммолью 4-хлорметилбензоила хлорида в ТГФ. Перемешивайте в течение 6 часов при температуре 60 °C.
- Синтезированные 8,10 ммоль HA-TBA и 0,41 ммоль линкера DS-Y30 растворить в смеси ТГФ и ацетонитрила (4:1, v/v). Перемешивайте в течение 5 часов при 40 °C.
- Удалите загрязнения путем фильтрации с помощью фильтрующего агента и удалите органический растворитель путем вакуумного испарения. Очистите продукт с помощью диализной мембраны (отсечка по молекулярной массе: 3,5 кДа) и лиофилизируйте.
2. Получение наночастиц
- Растворите 1 мг HB и 1 мг паклитаксела в 0,5 мл диметилсульфоксида (ДМСО) и смешайте с 0,5 мл DDW путем вихревого перемешивания в течение 5 минут. Затем растворите HACE в этой смеси путем вихревого перемешивания в течение еще 5 минут.
- Чтобы удалить растворитель, нагрейте до 70 °C в течение 4 часов под слабой струей газообразного азота.
- Повторно суспендируйте пленку, состоящую из HACE, HB и паклитаксела, с 1 мл DDW. Фильтр с помощью шприцевого фильтра (размер пор 0,45 мкм) для удаления некапсулированных препаратов.
3. Противоопухолевая эффективность in vivo у мышей с опухолями
- Мышиная модель, индуцированная раком легких
- Подготовьте 1 × 106 клеток А549 в среде 0,1 мл RPMI-1640; храните в льду.
- Обезболивайте мышей с помощью внутримышечной инъекции ксилазина и смеси тилетамина и золазепама (1:2, 1 мл/кг). Подтвердите правильную анестезию, аккуратно защипнув небольшую складку кожи мыши. Используйте ветеринарную мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
заметка: Если движения не наблюдается, животное находится под достаточной анестезией, чтобы начать эксперименты.
- Введите клетки подкожно в левые бока самцов голых мышей BALB/C (возрастом 6 - 7 недель, 20 - 22 г).
- Продолжайте наблюдать за мышами, пока они не начнут перемещаться по клетке.
заметка: Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Не стоит возвращать животное, перенесшее операцию, в компанию других животных до тех пор, пока оно полностью не выздоровеет. Держите мышей в определенных условиях, свободных от патогенов (SPF).
- Измеряйте размер опухоли с помощью штангенциркуля каждый день. Рассчитайте объем опухоли (мм3) как (длина × ширина2) / 2. Когда размер опухоли достигнет примерно 200мм3 в объеме, приступают к эксперименту.
- Исследование противоопухолевой эффективности
- Случайным образом разделите мышей на 4 группы (n = 10 для каждой группы).
- Обезболивайте мышей с помощью внутримышечной инъекции ксилазина и смеси тилетамина и золазепама (1:2, 1 мл/кг). Подтвердите правильную анестезию, аккуратно защипнув небольшую складку кожи мыши. Используйте ветеринарную мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
заметка: Если движения не наблюдается, животное находится под достаточной анестезией, чтобы начать эксперименты.
- Растворите наночастицы в PBS до конечной концентрации 2 мг/мл HB. Вводите PBS, свободный HB, HB-NP или HB-P-NP через хвостовую вену (2 мг/кг в виде HB) два раза в дни 0 и 7.
- Продолжайте наблюдать за мышами, пока они не начнут перемещаться по клетке.
заметка: Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Не стоит возвращать животное, перенесшее операцию, в компанию других животных до полного выздоровления. Держите клетки в темноте и при определенных условиях SPF.
- Через 24 часа после каждой инъекции обезболивайте мышей внутримышечным введением ксилазина и смеси тилетамина и золазепама (1:2, 1 мл/кг). Подтвердите правильную анестезию, аккуратно защипнув небольшую складку кожи мыши. Используйте ветеринарную мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
заметка: Если движения не наблюдается, животное находится под достаточной анестезией, чтобы начать эксперименты.
- Поместите место опухоли под волокно ФДТ (с расстоянием 1 см от волокна ФДТ до опухоли). Наденьте лазерные защитные очки, выключите выключатель и подсвечивайте опухоль лазером ФДТ (630 нм, 400 мВт/см2) в течение 500 сек (200 Дж/см2) два раза в 1-й и 8-й дни.
- Продолжайте наблюдать за мышами, пока они не начнут перемещаться по клетке. Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Не стоит возвращать животное, перенесшее операцию, в компанию других животных до полного выздоровления.
- Держите клетки в условиях SPF. Сохраняйте клетки в темноте в течение 24 часов после лазерной обработки.
- Визуальный контроль объема опухоли и изменений в месте опухоли каждый день. Измерьте размер опухоли штангенциркулем и рассчитайте объем как (длина × ширина2) / 2 (мм3). Делайте снимки участков опухоли каждый день, чтобы проверить наличие изменений поверхности опухоли после ФДТ.
- На 16-й день принесите в жертву пять мышей в каждой группе с помощью терминальной анестезии с использованием изофлурана.
- С помощью щипцов и ножниц разрежьте внешнюю кожу и обнажите опухоли. Аккуратно собирайте их. Зафиксируйте их в 10% формалине, погрузите в парафин и окрасьте гематоксилином и эозином (H&E) для гистологического анализа.
- После 45 дней наблюдения принесите оставшихся мышей в жертву путем терминальной анестезии с использованием изофлурана.