Анализ противоопухолевой эффективности ФДТ in vivo: методика определения фототоксического потенциала фотосенсибилизатора у мышей-носителей опухолей

Аннотация

Источник: Chang, J. E., et al. Противоопухолевая эффективность фотодинамической терапии с наночастицами, нацеленными на рак легких. J. Vis. Exp. (2016).

Фотодинамическая терапия (ФДТ) - это неинвазивный и нехирургический метод лечения рака легких. Фотосенсибилизаторы избирательно накапливаются в опухолевой ткани и приводят к гибели опухолевых клеток в присутствии кислорода и соответствующей длины волны света. В этом видео описывается анализ in vivo противоопухолевой эффективности с использованием фотосенсибилизатора, содержащего наночастицы, у мыши, несущей опухоль, для определения фототоксического потенциала фотосенсибилизатора.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Синтез гиалуроновой кислоты-керамида (HACE)

1. Солюбилизируйте 12,21 ммоль олигомера гиалуроновой кислоты (ГК) и 9,77 ммоль гидроксида тетра-н-бутиламмония (ТБК) в 60 мл дважды дистиллированной воды (ДДВ). Помешивайте 30 минут.
2. Для синтеза линкера DS-Y30 необходимо растворить 8,59 ммоль керамида DS-Y30 и 9,45 ммоль триэтиламина в 25 мл тетрагидрофурана (ТГФ). Смешать с 8,59 ммолью 4-хлорметилбензоила хлорида в ТГФ. Перемешивайте в течение 6 часов при температуре 60 °C.
3. Синтезированные 8,10 ммоль HA-TBA и 0,41 ммоль линкера DS-Y30 растворить в смеси ТГФ и ацетонитрила (4:1, v/v). Перемешивайте в течение 5 часов при 40 °C.
4. Удалите загрязнения путем фильтрации с помощью фильтрующего агента и удалите органический растворитель путем вакуумного испарения. Очистите продукт с помощью диализной мембраны (отсечка по молекулярной массе: 3,5 кДа) и лиофилизируйте.

2. Получение наночастиц

1. Растворите 1 мг HB и 1 мг паклитаксела в 0,5 мл диметилсульфоксида (ДМСО) и смешайте с 0,5 мл DDW путем вихревого перемешивания в течение 5 минут. Затем растворите HACE в этой смеси путем вихревого перемешивания в течение еще 5 минут.
2. Чтобы удалить растворитель, нагрейте до 70 °C в течение 4 часов под слабой струей газообразного азота.
3. Повторно суспендируйте пленку, состоящую из HACE, HB и паклитаксела, с 1 мл DDW. Фильтр с помощью шприцевого фильтра (размер пор 0,45 мкм) для удаления некапсулированных препаратов.

3. Противоопухолевая эффективность in vivo у мышей с опухолями

1. Мышиная модель, индуцированная раком легких
   1. Подготовьте 1 × 10⁶ клеток А549 в среде 0,1 мл RPMI-1640; храните в льду.
   2. Обезболивайте мышей с помощью внутримышечной инъекции ксилазина и смеси тилетамина и золазепама (1:2, 1 мл/кг). Подтвердите правильную анестезию, аккуратно защипнув небольшую складку кожи мыши. Используйте ветеринарную мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
      заметка: Если движения не наблюдается, животное находится под достаточной анестезией, чтобы начать эксперименты.
   3. Введите клетки подкожно в левые бока самцов голых мышей BALB/C (возрастом 6 - 7 недель, 20 - 22 г).
   4. Продолжайте наблюдать за мышами, пока они не начнут перемещаться по клетке.
      заметка: Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Не стоит возвращать животное, перенесшее операцию, в компанию других животных до тех пор, пока оно полностью не выздоровеет. Держите мышей в определенных условиях, свободных от патогенов (SPF).
   5. Измеряйте размер опухоли с помощью штангенциркуля каждый день. Рассчитайте объем опухоли (мм³) как (длина × ширина²) / 2. Когда размер опухоли достигнет примерно 200^мм3 в объеме, приступают к эксперименту.
2. Исследование противоопухолевой эффективности
   1. Случайным образом разделите мышей на 4 группы (n = 10 для каждой группы).
   2. Обезболивайте мышей с помощью внутримышечной инъекции ксилазина и смеси тилетамина и золазепама (1:2, 1 мл/кг). Подтвердите правильную анестезию, аккуратно защипнув небольшую складку кожи мыши. Используйте ветеринарную мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
      заметка: Если движения не наблюдается, животное находится под достаточной анестезией, чтобы начать эксперименты.
   3. Растворите наночастицы в PBS до конечной концентрации 2 мг/мл HB. Вводите PBS, свободный HB, HB-NP или HB-P-NP через хвостовую вену (2 мг/кг в виде HB) два раза в дни 0 и 7.
   4. Продолжайте наблюдать за мышами, пока они не начнут перемещаться по клетке.
      заметка: Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Не стоит возвращать животное, перенесшее операцию, в компанию других животных до полного выздоровления. Держите клетки в темноте и при определенных условиях SPF.
   5. Через 24 часа после каждой инъекции обезболивайте мышей внутримышечным введением ксилазина и смеси тилетамина и золазепама (1:2, 1 мл/кг). Подтвердите правильную анестезию, аккуратно защипнув небольшую складку кожи мыши. Используйте ветеринарную мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
      заметка: Если движения не наблюдается, животное находится под достаточной анестезией, чтобы начать эксперименты.
   6. Поместите место опухоли под волокно ФДТ (с расстоянием 1 см от волокна ФДТ до опухоли). Наденьте лазерные защитные очки, выключите выключатель и подсвечивайте опухоль лазером ФДТ (630 нм, 400 мВт/^см2) в течение 500 сек (200 Дж/^см2) два раза в 1-й и 8-й дни.
   7. Продолжайте наблюдать за мышами, пока они не начнут перемещаться по клетке. Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Не стоит возвращать животное, перенесшее операцию, в компанию других животных до полного выздоровления.
   8. Держите клетки в условиях SPF. Сохраняйте клетки в темноте в течение 24 часов после лазерной обработки.
   9. Визуальный контроль объема опухоли и изменений в месте опухоли каждый день. Измерьте размер опухоли штангенциркулем и рассчитайте объем как (длина × ширина²) / 2 (мм³). Делайте снимки участков опухоли каждый день, чтобы проверить наличие изменений поверхности опухоли после ФДТ.
   10. На 16-й день принесите в жертву пять мышей в каждой группе с помощью терминальной анестезии с использованием изофлурана.
   11. С помощью щипцов и ножниц разрежьте внешнюю кожу и обнажите опухоли. Аккуратно собирайте их. Зафиксируйте их в 10% формалине, погрузите в парафин и окрасьте гематоксилином и эозином (H&E) для гистологического анализа.
   12. После 45 дней наблюдения принесите оставшихся мышей в жертву путем терминальной анестезии с использованием изофлурана.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Олиго гиалуроновая кислота	Биоленд Ко., Лтд.
DS-Y30 (керамид 3B; в основном нолеоилфитосфингозин)	Doosan Biotech Co., Ltd.
дигидразид адипиновой кислоты	Сигма Олдрич	А0638
N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид	Сигма Олдрич	No 39391
4-(хлорметил)бензоилхлорид	Сигма Олдрич	270784
Паклитаксел	Корпорации Тайхуа
Шприцевой фильтр	Сарториус Стедим Биотех ГмбХ	17762	15 мм, RC, PP, 0,45 мкм
РПМИ-1640	Гибко Лайф Текнолоджис, Инк.	11875
Пенициллин–стрептомицин	Гибко Лайф Текнолоджис, Инк.	15070
Фетальная бычья сыворотка	Гибко Лайф Текнолоджис, Инк.	16140071
Celite (Фильтрующий агент)	Сигма Олдрич	No 6858	Смотрите шаг 1.4

г. г.