Трансплантация островков поджелудочной железы: метод имплантации островков поджелудочной железы в переднюю камеру глаза мыши для визуализации in vivo

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом Jove

1. Подготовка оборудования для трансплантации и операционного стола

ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты должны быть автоклавированы, а операционный стол и инструменты продезинфицированы 70% спиртом.

1. Подключите стереотаксический держатель головы к анестезии через маску для носа и включите грелку.
2. Подсоедините газоплотный шприц Hamilton к полиэтиленовой трубке и канюле с тупым торцевым ушком.
   заметка: Перед сборкой рекомендуется заполнить все детали PBS. Проверьте наличие пузырьков воздуха и удалите их, если они есть.
3. Плотно прикрепите шприц Гамильтона к столу (рис. 1a) или подвижному основанию (рис. 1e) и прикрепите трубку к стереомикроскопу так, чтобы канюля свисала вниз (т. е. в положении ожидания).
   заметка: Используйте хирургическую ленту, потому что ее легко снять и снова прикрепить.
4. Приготовьте шприц объемом 1 мл, подключенный к игле 30 г, заполненной 0,1 мг/кг раствора бупренорфина.
5. Приготовьте шприц со стерильным PBS. В качестве альтернативы можно использовать пипетку.
6. Отставьте в сторону чистую клетку для будильника с нагревательной лампой.

2. Анестезия и позиционирование мышей-реципиентов для операции

ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные были выращены и содержались в свободной от патогенов среде в помещениях для животных в Лундском университете.

1. Обезболите мышь в камере, заполненной 40% O₂/60% N₂/3% изофлурана и перенесите обезболенную мышь на платформу для держателя головы на теплой грелке (рис. 1a). Проверьте на отсутствие педальных рефлексов.
   заметка: Изофлурановая анестезия является предпочтительным методом обезболивания для быстрого восстановления после операции. Помещение для микроскопа должно хорошо проветриваться для использования изофлурана.
2. Поместите морду мыши в анестезиологическую маску, соединенную с аппаратом для анестезии 40% O₂ / 60% N₂ 0,9%–1,5% изофлурана. Большим и указательным пальцами слегка приподнимите голову вверх и закрепите ее с помощью металлических деталей по бокам. Убедитесь, что наушники фиксируют голову непосредственно под ушами. Введите 0,1 мг/кг раствора бупренорфина подкожно на спину мыши.
   заметка: Бупренорфин используется в качестве обезболивающего средства.
3. Наклоните голову так, чтобы оперируемый глаз был направлен вверх и находился близко к исследователю.
4. Аккуратно втяните веки пересаживаемого глаза с помощью тупых щипцов, вытащите глаз и свободно зафиксируйте пинцетом. Убедитесь, что кончики пинцета закрыты полиэтиленовой трубкой, прикрепленной к платформе держателя головки (рис. 1a, вставка).
5. Всегда держите оба глаза влажными, нанося каплю стерильного PBS на глаз.
6. Перенесите островки человека из герметичной пробирки объемом 1,5 мл (секция 1) в чашку Петри со стерильным PBS и убедитесь, что островки находятся близко друг к другу, чтобы свести к минимуму количество переносимых питательных сред для клеточных культур (рис. 1c).
7. Захватите ~20–30 островков в глазной канюле, подключенной через полиэтиленовую трубку к шприцу Hamilton.
   заметка: Употребляйте как можно меньше жидкости с островками.
8. Повесьте трубку вверх ногами и прикрепите к стереомикроскопу (рисунок 1d). Осторожно обмотайте трубку лентой, чтобы островки опускались к концу трубки по направлению к канюле.

3. Процедура трансплантации

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был ранее описан для трансплантации островков мыши. Здесь представлена немного измененная процедура.

1. Зажмите подушечки на задних лапах, чтобы убедиться, что мышь спит.
2. Затяните щипцы, ограничивающие глаз, не нарушая кровоток, и нанесите на глаз каплю стерильного PBS.
3. Используя иглу 25 G в качестве скальпеля, скосите вверх, осторожно проникните только в половину кончика в роговицу и сделайте один боковой разрез. Сделайте отверстие под углом вверх; после пересадки отверстие будет легче запечататься (Рисунок 1f).
4. Осторожно приподнимите роговицу с предварительно загруженной канюлей и медленно приложите островки к глазу. Избегайте введения канюли в переднюю камеру, чтобы предотвратить повреждение радужной оболочки, а лучше осторожно надавите на отверстие роговицы (Рисунок 1g). Медленно оттяните канюлю от АПФ.<бр /> заметка: Стремитесь к объему инъекции 3–8 μл. Если объем слишком большой, это подвергнет глаз неоправданно высокому внутриглазному давлению и может привести к выведению введенных островков из передней камеры.
5. При возникновении трудностей с введением островков из-за повышенного давления в камере глаза увеличьте место разреза, укрепив место бокового разреза, и повторно наложите островки.
   заметка: Иногда введенные пузырьки воздуха могут использоваться в качестве держателей пространства.
6. Нанесите глазной гель на глаз, ослабьте щипцы, ограничивающие глаза, и оставьте мышь на изофлуране в том же положении на 8–10 минут, чтобы островки схватились.
7. Снимите щипцы, удерживающие веко, и верните веко в нормальное положение.
8. Извлеките мышь из держателя для головы и перенесите ее в клетку для пробуждения.
9. Когда мышь проснется и начнет двигаться, перенесите ее обратно в исходную клетку и держите в помещении для животного до сканирования (рекомендуется не менее 5 дней).

Рисунок 1: Трансплантация островков поджелудочной железы в переднюю камеру глаза.
(a) Установка для трансплантации, показывающая мышь под наркозом, зафиксированную в стереотаксическом держателе головки, и открытый глаз (вставка) рядом с подготовленным шприцем Гамильтона, прикрепленным к столу, и стереомикроскопом, готовым к выбору островков мыши (b) или островков человека (c). (d) Положение ожидания глазной канюли, загруженной островками. (e) Трансплантация в процессе и (f) схематическое изображение одного бокового разреза, используемого для осторожного поднятия роговицы кончиком глазной канюли и введения островков в переднюю камеру (g). Изображение глаза сразу после инъекции мышиных островков (h) или человеческих островков (i). Масштабная линейка = 500 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.