Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом Jove
1. Подготовка оборудования для трансплантации и операционного стола
ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты должны быть автоклавированы, а операционный стол и инструменты продезинфицированы 70% спиртом.
- Подключите стереотаксический держатель головы к анестезии через маску для носа и включите грелку.
- Подсоедините газоплотный шприц Hamilton к полиэтиленовой трубке и канюле с тупым торцевым ушком.
заметка: Перед сборкой рекомендуется заполнить все детали PBS. Проверьте наличие пузырьков воздуха и удалите их, если они есть.
- Плотно прикрепите шприц Гамильтона к столу (рис. 1a) или подвижному основанию (рис. 1e) и прикрепите трубку к стереомикроскопу так, чтобы канюля свисала вниз (т. е. в положении ожидания).
заметка: Используйте хирургическую ленту, потому что ее легко снять и снова прикрепить.
- Приготовьте шприц объемом 1 мл, подключенный к игле 30 г, заполненной 0,1 мг/кг раствора бупренорфина.
- Приготовьте шприц со стерильным PBS. В качестве альтернативы можно использовать пипетку.
- Отставьте в сторону чистую клетку для будильника с нагревательной лампой.
2. Анестезия и позиционирование мышей-реципиентов для операции
ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные были выращены и содержались в свободной от патогенов среде в помещениях для животных в Лундском университете.
- Обезболите мышь в камере, заполненной 40% O2/60% N2/3% изофлурана и перенесите обезболенную мышь на платформу для держателя головы на теплой грелке (рис. 1a). Проверьте на отсутствие педальных рефлексов.
заметка: Изофлурановая анестезия является предпочтительным методом обезболивания для быстрого восстановления после операции. Помещение для микроскопа должно хорошо проветриваться для использования изофлурана.
- Поместите морду мыши в анестезиологическую маску, соединенную с аппаратом для анестезии 40% O2 / 60% N2 0,9%–1,5% изофлурана. Большим и указательным пальцами слегка приподнимите голову вверх и закрепите ее с помощью металлических деталей по бокам. Убедитесь, что наушники фиксируют голову непосредственно под ушами. Введите 0,1 мг/кг раствора бупренорфина подкожно на спину мыши.
заметка: Бупренорфин используется в качестве обезболивающего средства.
- Наклоните голову так, чтобы оперируемый глаз был направлен вверх и находился близко к исследователю.
- Аккуратно втяните веки пересаживаемого глаза с помощью тупых щипцов, вытащите глаз и свободно зафиксируйте пинцетом. Убедитесь, что кончики пинцета закрыты полиэтиленовой трубкой, прикрепленной к платформе держателя головки (рис. 1a, вставка).
- Всегда держите оба глаза влажными, нанося каплю стерильного PBS на глаз.
- Перенесите островки человека из герметичной пробирки объемом 1,5 мл (секция 1) в чашку Петри со стерильным PBS и убедитесь, что островки находятся близко друг к другу, чтобы свести к минимуму количество переносимых питательных сред для клеточных культур (рис. 1c).
- Захватите ~20–30 островков в глазной канюле, подключенной через полиэтиленовую трубку к шприцу Hamilton.
заметка: Употребляйте как можно меньше жидкости с островками.
- Повесьте трубку вверх ногами и прикрепите к стереомикроскопу (рисунок 1d). Осторожно обмотайте трубку лентой, чтобы островки опускались к концу трубки по направлению к канюле.
3. Процедура трансплантации
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был ранее описан для трансплантации островков мыши. Здесь представлена немного измененная процедура.
- Зажмите подушечки на задних лапах, чтобы убедиться, что мышь спит.
- Затяните щипцы, ограничивающие глаз, не нарушая кровоток, и нанесите на глаз каплю стерильного PBS.
- Используя иглу 25 G в качестве скальпеля, скосите вверх, осторожно проникните только в половину кончика в роговицу и сделайте один боковой разрез. Сделайте отверстие под углом вверх; после пересадки отверстие будет легче запечататься (Рисунок 1f).
- Осторожно приподнимите роговицу с предварительно загруженной канюлей и медленно приложите островки к глазу. Избегайте введения канюли в переднюю камеру, чтобы предотвратить повреждение радужной оболочки, а лучше осторожно надавите на отверстие роговицы (Рисунок 1g). Медленно оттяните канюлю от АПФ.<бр />
заметка: Стремитесь к объему инъекции 3–8 μл. Если объем слишком большой, это подвергнет глаз неоправданно высокому внутриглазному давлению и может привести к выведению введенных островков из передней камеры.
- При возникновении трудностей с введением островков из-за повышенного давления в камере глаза увеличьте место разреза, укрепив место бокового разреза, и повторно наложите островки.
заметка: Иногда введенные пузырьки воздуха могут использоваться в качестве держателей пространства.
- Нанесите глазной гель на глаз, ослабьте щипцы, ограничивающие глаза, и оставьте мышь на изофлуране в том же положении на 8–10 минут, чтобы островки схватились.
- Снимите щипцы, удерживающие веко, и верните веко в нормальное положение.
- Извлеките мышь из держателя для головы и перенесите ее в клетку для пробуждения.
- Когда мышь проснется и начнет двигаться, перенесите ее обратно в исходную клетку и держите в помещении для животного до сканирования (рекомендуется не менее 5 дней).
