1. Органоидная культура и препараты перед электропорацией
- Определение органоидов путем расщепления тканей, как описано ранее, и их расширение с помощью соответствующей питательной среды, специфичной для конкретного объекта, в обзоре матрицы основания см. Таблицу 1 и Таблицу материалов
заметка: Для образцов тканей человека необходимо информированное согласие и одобрение исследования этическим комитетом.
- Предварительно прогрейте 48-луночные планшеты при 37 °C для посева после электропорации.
- Готовят базальную среду без антибиотиков, а также специфичную для сущностей органоидную культуральную среду без антибиотиков (см. таблицу 1), включая 10 мкМ Y-27632 и 3 мкМ CHIR99021,<бр/>
заметка: Отмена антибиотиков важна для снижения токсических эффектов. Y-27632 и CHIR99021 улучшают восстановление клеток.
- Получение органоидов (см. Рисунок 1)
- Культивируйте 5 лунок органоидов в 48-луночном планшете на каждый образец электропорации в питательной среде.
заметка: Следует использовать пролиферативные органоиды (примерно через 2-3 дня после последнего расщепления).
- Приготовьте 230 мкл диссоциационного реагента (см. таблицу материалов), в том числе 10 мкМ Y-27632 на лунку.
- Удалите питательную среду из каждой лунки и механически диссоциируйте органоиды в 230 мкл приготовленной диссоциационной смеси. Объедините 5 лунок на каждый образец электропорации в одну пробирку объемом 15 мл.
- Перемешайте в вортексе и инкубируйте в течение 5-15 минут при 37 °C до образования кластеров из 10-15 клеток. Поэтому проверьте диссоциацию под микроскопом. Остановка пищеварения путем добавления базальной среды без антибиотиков до 10 мл.<бр/>
заметка: Этот шаг очень важен! Эффективность электропорации будет снижена, когда инкубация будет слишком короткой, но долгое сбраживание снизит выживаемость.
- Центрифугируйте при 450 x g в течение 5 минут при комнатной температуре, выбросьте надосадочную жидкость и дважды промойте 4 мл буфера для электропорации (см. Таблицу материалов).
2. Электропорация
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол разработан для электропораторов, способных работать с прямоугольными волнами и разделенными последовательностями импульсов порирования и переноса (см. Рисунок 2). В качестве контроля для воспроизводимых экспериментов можно дополнительно измерить значения импеданса, а также напряжения, токи и энергии, передаваемые в образец.
- Ресуспендировать органоидную гранулу в 100 мкл электропорационного буфера (см. Таблицу материалов), содержащем 30 мкг плазмидной ДНК.
заметка: Концентрация используемой плазмидной ДНК должна превышать 5 мкг/л для достижения оптимальной концентрации соли в процессе электропорации. Поэтому для получения векторов рекомендуется использовать эндосвободные плазмидные макси-наборы (см. Таблицу материалов). Общее количество до 45 мкг ДНК может быть использовано без цитотоксических эффектов.
- Дозируйте полную смесь ДНК-органоидов в электропорационную кювету с шириной зазора 2 мм без образования пузырьков воздуха.
- Задайте параметры электропорации (см. табл. 2, рис. 2).
- Слегка перемешайте ячейки без вспенивания, постукивая пальцем по кювете. Поместите кювету в камеру кюветы.
- Нажмите кнопку Ω электропоратора и запишите значение импеданса.
заметка: Импеданс в диапазоне 30-40 Ω показал наилучшие результаты. В целом, она должна быть в пределах 30-55 Ω. Если это не так, пожалуйста, контролируйте следующие аспекты: ширина зазора используемой кюветы, кабельные соединения электропоратора, возможные пузырьки воздуха, правильный объем и концентрация соли в электропорационной смеси.
- Нажмите кнопку «Пуск» для выполнения программы электропорации и управления отображаемыми значениями токов, напряжений и энергий.
заметка: Значения измеряемых напряжений, токов и энергий должны соответствовать заданным параметрам электропорации. Для сравнения повторных экспериментов может быть полезно обратить внимание на эти данные.
- После электропорации немедленно добавьте 500 мкл питательной среды без антибиотиков (с CHIR99021 и Y-27632; см. шаг 1.3). Перемешайте пипеткой вверх и вниз, чтобы диссоциировать белую пену.
заметка: Белая пена появляется после процесса электропорации и к ней прикрепляется значительное количество ячеек. Таким образом, его диссоциация очень важна для того, чтобы не потерять клетки.
- Полностью перенесите образец из кюветы в новую пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки, относящейся к электропорационным кюветам (см. Таблицу материалов). Рекомендуется еще раз промыть кювету базальной средой для получения оставшихся клеток.
- Для регенерации клеток инкубируйте их в течение 40 минут при комнатной температуре.
3. Посев клеток
- Центрифугируйте клетки при давлении 450 х г в течение 5 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
- Повторно суспендируйте гранулу в 100 мкл базовой матрицы и затравите капли 20 мкл в предварительно подогретый 48-луночный планшет (см. шаг 1.2). Инкубировать в течение 10 мин при 37 °C для полимеризации и добавить 250 мкл питательной среды, которую добавляют Y-27632 и CHIR99021 до следующего расщепления выращенных органоидов (около 5-7 дней).
4. Определение эффективности трансфекции
ПРИМЕЧАНИЕ: В общем случае, рекомендуется электропорировать вектор, несущий флуоресцентный маркер, в качестве дополнительного контроля трансфекции. В зависимости от выбранного маркера и созревания его хромофора, флуоресценция будет видна примерно через 24-48 ч после трансфекции18.
- Проверьте флуоресценцию под микроскопом через 24-48 ч в трансфекционном контроле (рис. 3В)
Таблица 1: Состав базальных сред, смесей для сбраживания и питательных сред.
| Базальные средние компоненты: | я | Глава II |
| Усовершенствованный DMEM/F-12 | - T | - T |
| Глутамакс | 1x | 1x |
| Хепес | 10 мМ | 10 мМ |
| Пенициллин стрептомицин | - T | 1x |
| Примоцин | 1x | - T |
| Установление путем сбраживания |
| Смесь для пищеварения: | двоеточие | Желудок | Печень | Поджелудочная железа |
| нормальный | опухолевый | нормальный | опухолевый | нормальный | опухолевый | нормальный | опухолевый |
| Коллагеназа II | - T | - T | - T | - T | - | 0.625 мг/мл |
| Коллагеназа XI | - T | 0,1 мг/мл | - T | 0,1 мг/мл | - | - |
| Коллагеназа D | - T | - T | - T | - T | 2.5 мг/мл | - |
| Диспаза II | - T | 1 мг/мл | - T | 1 мг/мл | - | 2.5 мг/мл |
| ДНКаза I | - T | - T | - T | - T | 0.1 мг/мл | - |
| Эдта | 2 мМ | - T | 10 мМ | - T | - | - |
| Разбавленный в | Хелатирующий буфер* | Базальная среда I | Хелатирующий буфер* | Базальная среда I | in EBSS | Базальная среда I |
| Инкубация для: | 0,5 ч на льду | 1 час при 37°C | 0,25-0,5 ч по RT | 1 час при 37°C | 0,5-1 ч при 37°C | 1,5 ч при 37°C | 0,5-1 при 37°C | 2-3 ч при 37°C |
| По материалам справочника: | Sato et al. 2011 | Bartfeld et al. 2015 | Broutier et al. 2016 | Hennig et al. 2019 |
| Среда для выращивания (Базовая: Базальная среда II) |
| А83-01 | 0,5 мкМ | 2 мкМ | 5 мкМ | 0.5 μM |
| В27 | 1x | 1x | 1x | 1x |
| B27 без витамина А | - T | - T | 1x | - |
| Форсколин | - T | - T | 10 μМ | - |
| ХФГФ-10 | - T | 200 нг/мл | 100 нг/мл | 100 нг/мл |
| hHGF | - T | - T | 25 нг/мл | - |
| [Leu15] Гастрин | 10 нМ | 1 нМ | 10 нМ | 10 нМ |
| mEGF | 50 нг/мл | 50 нг/мл | 50 нг/мл | 50 нг/мл |
| N2 | - T | - T | 1x | - T | 1x |
| N-ацетил-L-цистеин | 1,25 мМ | 1 мМ | 1 мМ | 1 мМ |
| Никотинамид | 10 мМ | 10 мМ | 10 мМ | 10 мМ |
| башка | 10 % | 10 % | - T | 10 % |
| Примоцин | 1x (100 мкг/мл) | 1x (100 мкг/мл) | 1x (100 мкг/мл) | 1x (100 μг/мл) |
| Простагландин Е2 | 10 нМ | - T | - T | - T | 1 мкМ |
| Рспондин | 20 % | 10 % | 10 % | 10 % |
| SB202190 | 3μМ | - T | - T | - |
| Wnt3A | 50 % | 50 % | - T | 50 % |
| *Хелатирующий буфер: 5,6 мМ Na2HPO4, 8,0 мМ KH2PO4, 96,2 мМ NaCl, 1,6 мМ KCl, 43,4 мМ сахарозы, 54,9 мМ d-сорбитола, 0,5 мМ dl-дитиотреитол в дистиллированной воде |
