1. Пищеварение при опухолях поджелудочной железы
- Поместите рассеченную опухоль поджелудочной железы, опухоли метастатического очага или здоровую ткань поджелудочной железы в ледяную PBS и храните на льду.
- С помощью щипцов перенесите опухоль на чашку Петри.
- Добавьте 5,0 мл питательной среды (2 мг/мл коллагеназы, 0,025 мг/мл ДНазы RPMI) в пробирку объемом 50 мл; храните на льду, чтобы предотвратить начало активности ферментов.
заметка: В этом протоколе используется коллагеназа V типа, которая имеет активность ≥1 единицы/мг FALGPA, и > 125 единиц переваривания коллагена (CDU)/мг твердого вещества. Аликвоты коллагеназы и ДНКазы можно хранить при температуре -20 °C и размораживать на льду перед использованием. Когда оба они полностью растворяются в стерильных RPMI, их можно пропустить через фильтр 0,2 мкм для удаления загрязнений. Коллагеназа должна быть полностью растворена перед фильтрацией, чтобы избежать потерь материала.
- Возьмите небольшую аликвоту этого раствора, чтобы покрыть опухоль на чашке Петри.
- С помощью стерильного скальпеля и щипцов разрежьте опухоль на небольшие кусочки, примерно менее 3 мм в длину.
- Соскребите кусочки опухоли в пробирку и аккуратно переверните пробирку, пока все части не будут погружены в среду для пищеварения. Хранить на льду, если необходимо подготовить другие образцы опухоли в партии.
- Перенесите на встряхивающее устройство на 20 минут при температуре 37 °C. Убедитесь, что все части опухоли погружены в воду и не прилипают к краю трубки. Если встряхивание невозможно, то делайте вихревой анализ образца каждые 5 минут, чтобы помочь пищеварению.
2. Приготовление суспензии одиночных клеток из переваренной опухоли
- Сразу после этапа пищеварения поместите трубку на лед, чтобы замедлить активность ферментов.
- Добавьте ЭДТА для достижения конечной концентрации 20 мМ и кратковременно перемешайте образец. Это еще больше замедлит активность ферментов.
- Откройте пробирку и смойте остатки опухоли с крышки пробирки свежей средой RPMI.
- Приготовьте ситечко размером 70 мкм (размер ситечка может быть изменен по желанию) на открытой пробирке объемом 50 мл на льду.
- Предварительно смочите фильтр средой.
- Повторно суспензируйте переваренные клетки и промойте боковые стороны трубки с помощью полоски объемом 25 мл или больше. Более широкое отверстие полоски важно для того, чтобы густой дижест мог легко проходить.
- Переложите весь дигест с помощью полоски объемом 25 мл на ситечко.
- Разомните опухоль поверх фильтра с помощью поршня шприца объемом 1 мл. Затирайте только прямо вверх и вниз, чтобы свести к минимуму напряжение сдвига для клеток.
- Непрерывно промывайте ячейки через сетчатое фильтр с помощью RPMI. Убедитесь, что вы моете с достаточным усилием, чтобы протолкнуть ячейки.
- Если материал для пюре все еще есть, но RPMI перестает промываться, сетчатый фильтр будет пропитан. Поэтому перенесите образец в новый фильтр и продолжите.
заметка: В конечном итоге в фильтре останутся только компоненты внеклеточного матрикса, через который должны пройти все одиночные клетки.
- Центрифугируйте пробирку в течение 5 минут при 300 x g и 4 °C.
- Осторожно ресуспендируйте клеточную гранулу в полной RPMI и пропустите непосредственно через другой фильтр, чтобы удалить любой внеклеточный матрикс или крупные клеточные сгустки, которые не могут быть адекватно ресуспендированы.
- На этом этапе, если стимуляция не требуется, немедленно окрашивайте выделенные клетки для анализа проточной цитометрии, пропуская центрифугирование планшета в течение 5 минут при 300 x g и 4 °C. Удалите надосадочную жидкость, перевернув планшет одним резким движением. В качестве альтернативы их можно повторно суспендировать в замораживающей среде (10% ДМСО в FBS) и хранить при температуре -80 °C с последующим длительным хранением в жидком азоте><.
заметка: Этап замораживания может позволить очистить иммунные клетки в более поздние сроки; Тем не менее, количественная оценка субпопуляций иммунных клеток может потребовать оптимизации, чтобы подтвердить, что количество клеток и фенотип не зависят от процесса замораживания/размораживания. Стимуляция Т-клетками ex vivo лучше всего проводится на свежих образцах опухолей. На этом этапе образец может быть дополнительно очищен с помощью удаления мертвых клеток на основе гранул или анализов обогащения иммунными клетками, если это необходимо.
3. Подготовка клеток к стимуляции ex vivo
- Подсчитайте клетки для достижения концентрации 2 x 106/100 μL в полной среде (RPMI 10 % FBS, 1X пенициллин и 1X стрептомицин).
заметка: Большое количество покрытых клеток гарантирует, что в этом образце будет достаточное количество Т-клеток для анализа. Тем не менее, это число может быть увеличено или уменьшено в зависимости от доступности образца и редкого характера подмножеств Т-клеток, представляющих интерес.
- Планшет 100 мкл клеток в 96-луночном планшете с U-образным дном.
- Добавьте 100 мкл готовой среды, содержащей 2-кратный препарат PMA/иономицина (для достижения конечной концентрации 0,081 мкМ и 1,34 мкМ соответственно, как рекомендовано производителем).
заметка: При измерении дегрануляции/экзоцитоза сюда также следует включить флуоресцентно конъюгированный антимышиный CD107a в среду. Также необходимо провести контрольный образец, не содержащий CD107a.
- Поместите в инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2 на 1 час.
- Добавьте 20 мкл 10-кратного препарата брефельдина А и монензина (для достижения конечной концентрации 1,06 мкМ и 2,0 мкМ соответственно (в соответствии с рекомендациями производителя) в готовую среду.
заметка: Брефельдин А и монензин являются ингибиторами транспорта белков и, таким образом, блокируют внеклеточное высвобождение цитокинов и т.д., что позволяет обнаруживать их с помощью проточной цитометрии. Если измерять выделение цитокинов в надосадочную жидкость методом ИФА или аналогичными методами – то этот этап можно пропустить.
- Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C и 5%CO2 еще на 4 часа.
