Визуализация динамики кальция в клетках поджелудочной железы: метод изучения изменений концентрации цитозольного кальция в островках поджелудочной железы в режиме реального времени

Аннотация

Источник: Hamilton, A., et al. Визуализация динамики кальция в субпопуляциях островковых клеток поджелудочной железы мышей. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео описывает технику визуализации островковых клеток в реальном времени для изучения изменений концентрации цитозольного кальция в малых субпопуляциях островковых клеток поджелудочной железы. Субпопуляции малых клеток могут быть идентифицированы с помощью функциональных реакций на маркерные соединения, такие как адреналин и грелин, которые вызывают изменения цитозольного кальция в определенных популяциях островковых клеток. Это может дать представление о перекрестных помехах между уровнем глюкозы в крови и секреторным выходом островков.

Протокол

1. Загрузите краситель или сформулируйте датчик

1. Приготовьте улавливаемый краситель.
   1. Растворите аликвоту (обычно 50 мкг) улавливаемого красителя (например, Fluo-4) в ДМСО до исходной концентрации 2 мМ. Добавьте плуроновую кислоту до конечной концентрации 1% (используя 20% запас в ДМСО), чтобы улучшить солюбилизацию красителя.
   2. Аликвотируйте краситель в небольшие ПЦР-пробирки (по 2 мкл в каждую). Краситель можно хранить в замороженном виде (-20 °C) в течение нескольких недель.
2. В качестве альтернативы можно подготовить рекомбинантный датчик.
   1. Распределите сенсор (например, аденовирусный вектор, кодирующий GCaMP6f) на 10 мкл аликвот и храните при -80 °C.
   2. (Необязательно) предварительно протестируйте титр вирусного запаса путем инфицирования островков (как показано ниже) с использованием нескольких последовательных разведений, чтобы выявить оптимальную концентрацию для инфекции.
      заметка: Рекомбинантные сенсоры, кодируемые разными векторами (лентивирус, BacMam, AAV), требуют другого протокола заражения. Обязательно уточните это у поставщика векторов и оптимизируйте рабочее соотношение для ваших нужд. «Рабочий» запас аденовируса может храниться при температуре -20 °С и несколько раз замораживаться/размораживаться. Чрезмерный цикл замораживания-оттаивания снижает эффективный титр вируса.
3. Приготовьте раствор для визуализации.
   1. Состав раствора для визуализации, мМ: 140 NaCl, 4,6 KCl, 2,6 CaCl₂, 1,2 MgCl₂, 1₂PO₄, 5 NaHCO₃, 10 HEPES (pH 7,4, с NaOH).
   2. Восполните запас глюкозы (0,5 М) и маннита (0,5 М) в растворе для визуализации. Бульон можно хранить в холодильнике (4 °C) в течение нескольких недель.
4. Загрузите ловкий краситель.
   1. Готовьте рабочий раствор красителя, растворяя 2 мкл красителя в 600 мкл раствора для визуализации, содержащего 6 мМ глюкозы. Раствор может быть нагретым или вортексным для улучшения солюбилизации.
   2. Загрузите изолированные островки в рабочий раствор красителя. Загрузка может осуществляться с помощью многолуночной пластины или чашки Петри. В последнем случае каплю рабочего раствора объемом 100 мкл положите на дно неклейкой чашки Петри (35 или 60 мм) и нанесите пипетку на 10-30 островков в каплю.
   3. В случае разных групп островков (например, дикого типа/выбивки), расположите несколько скважин и несколько капель так, чтобы загрузка могла производиться одновременно.
   4. Островки инкубировать в рабочем растворе красителя при комнатной температуре в темноте в течение 70-90 минут. Не переусердствуйте с инкубацией.
   5. Проверьте нагрузку под флуоресцентным микроскопом, островки должны приобрести мягкую флуоресценцию, при этом некоторые клетки будут ярче остальных. Округление клеток и ядерная локализация красителя являются признаками перегрузки.
   6. Перенесите островки в раствор для визуализации без красителей, содержащий 6 мМ глюкозы. Островки можно использовать для визуализации немедленно, но по желанию краситель можно оставить для деэтерификации еще на 10-15 минут. Островки сохраняют краситель в течение нескольких часов и поэтому могут использоваться для визуализации в несколько смен.
5. В качестве альтернативы можно заразить островки рекомбинантным вектором.
   1. Положите островки в виде капель в питательную среду RPMI (RMPI1640 (см. Таблицу материалов), с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Разлейте среду в две 60-миллиметровые пластиковые чашки Петри (не обработанные клеем) и храните чашки в инкубаторе (37 °C, 5%_CO2, абсолютная влажность)). (например, 30 мкл), чтобы свести к минимуму необходимый объем вектора.
   2. Сложите вектор в соотношении примерно 10:⁵ инфекционных единиц/островок, что в идеале должно привести к множественности инфекций >2. В идеале соотношение должно быть оптимизировано до минимального соотношения, которое обеспечивало бы экспрессию в периферическом слое. Может помочь предварительное титрование (шаг 1.2.2).
   3. Введите в каплю 20-50 островков и культуру на 8-48 часов. (В идеале – на ночь). Островки должны развивать слабую зеленую флуоресценцию в большинстве клеток, без изменений в морфологии клетки.
      заметка: Успех инфекции и экспрессии зависит от времени контакта с раствором вируса. В идеале вирус должен оставаться в растворе в течение ночи, но при необходимости может быть удален уже через 15 минут. Тем не менее, инфекционность и, следовательно, экспрессия, вероятно, будут значительно ниже.

2. Визуализация динамики Ca²⁺

1. Иммобилизуйте островки под (инвертированным) микроскопом.
   1. Соберите камеру для визуализации для инвертированной микроскопии. Поместите стеклянную защитную крышку (толщина 1 или 1,5) внутрь камеры и убедитесь, что интерфейс стекла и камеры водонепроницаем. Убедитесь, что покровное стекло находится в пределах досягаемости объектива микроскопа (критически важно в случае громоздкого объектива с высоким уровнем NA).
   2. Подготовьте принадлежности для иммобилизации. Вырежьте небольшие прямоугольники (20 мм х 20 мм) из мелкой и крупной ячеи. Введите две распорные «стенки» на мелкую сетку с помощью липкой ленты толщиной 45-50 мкм. Используйте двойные слои распорки, если размер островков, которые необходимо изобразить, значительно превышает условные 100 мкм.
   3. Погрузите сетки и груз в раствор для визуализации с помощью чашки Петри диаметром 35 мм. Убедитесь, что пластик и металл влажные.
   4. Под диссекционным микроскопом переверните мелкую сетку со «стенками» распорки вверх дном, распорками вверх. Выберите несколько островков, загруженных улавливаемым красителем или сцеживающих рекомбинантный сенсор с помощью пипетки P20, и аккуратно расположите их поверх мелкой сетки, между двумя прокладками. Убедитесь, что сетка и шайбы не содержат чрезмерного количества раствора для визуализации.
   5. Возьмите сетку с островками с помощью часовых щипцов и расположите ее вверх ногами внутри камеры визуализации так, чтобы распорки были обращены вниз и сидели прямо на покровном стекле камеры. Убедитесь, что островки зажаты между распорками и сеткой, в середине покровного стекла.
   6. Поместите грубую сетку и груз поверх мелкоячеистой ячейки в камере. Введите раствор для визуализации в камеру. Убедитесь, что островки обездвижены и готовы к визуализации. Избегайте чрезмерного встряхивания камеры (допустимы небольшие возмущения, такие как перенос камеры к микроскопу и вставка в нагретый предметный столик).
      заметка: Аналогичное иммобилизационное устройство может быть применено для вертикальной системы.
2. Установите микроскоп.
   1. Выберите режим визуализации и объектив, расположите камеру с островками из шага 2.1 на предметном столике микроскопа с регулируемой температурой.
      1. Установите регулятор температуры (в идеале от 30 °C до 36 °C) и перфузию. Для инвертированной системы расположите приток ниже, чем выходной поток в камере, и установите поток на выходе больше, чем поток на входе (что обычно достигается за счет использования трубки более широкого внутреннего диаметра на перистальтическом насосе).
      2. Убедитесь, что выходной продукт имеет минимальную поверхность контакта с раствором, чтобы он удалял раствор несколькими последовательными мелкими каплями, избегая длительных интервалов непрерывного удаления раствора. Последний является основным источником артефактов в покадровой съемке периодических сигналов, поскольку они проявляются как регулярные периодические интенсивные колебания каждого отображаемого пикселя и часто интерпретируются как «медленные волны».
      3. Начните перфузию с помощью раствора для визуализации, содержащего 3 мМ глюкозы.
   2. Выберите световой путь и фильтры для визуализации зеленых флуорофоров; возбуждение между 470 и 500 и излучение между 505 и 550 будут работать для каждого из них.
   3. Запустите образ в реальном времени, чтобы настроить параметры изображения. Настройте вид так, чтобы захватить интересующие островки.
   4. Оптимизируйте соотношение сигнал/шум изображения. Для этого отрегулируйте интенсивность возбуждающего света, время экспозиции и группирование. Убедитесь, что настройки позволяют отчетливо визуализировать каждую ячейку в островке при минимально возможной интенсивности света и воздействии.
   5. Выполнение получения изображений. В зависимости от поставленной задачи снимки могут быть сделаны с частотой от 0,1 до 5 Гц. Это значительно ниже критериев Найквиста для быстрых Na⁺-индуцированных колебаний в α- и δ-ячейках (>300 Гц), что означает, что данные по умолчанию недодискретизированы. Однако увеличение частоты регистрации для удовлетворения этого спроса нецелесообразно при многоклеточной/многоостровковой визуализации с большим полем зрения. GCaMP может быть изображен быстрее, в то время как Fluo4 неизбежно будет обесцвечиваться в условиях быстрого обнаружения.
      заметка: Учитывая, что колебания [Ca²⁺]_cyt в островковых клетках обусловлены электрической активностью, использование низких скоростей захвата может показаться контрпродуктивным. В действительности, однако, скорости регистрации на частоте около или выше 1 Гц могут быть достаточными для разрешения поведения спайков β-клеток, в то время как порог для регистрации колебаний, управляемых натриевыми каналами, в α- и δ-элементах значительно превышает 300 Гц. Независимо от того, регистрируются ли колебания α- или δ-клеточного [^Ca2+]_цита с частотой 1 Гц или 0,1 Гц, они будут сильно занижены и отражают обработку^Ca2+ клеткой, а не электрическую активность.
      1. Проверьте качество полученных данных: при концентрации глюкозы в 3 мМ активность α-клеток должна быть четко видна/детектируема. Убедитесь, что это так, и приступайте к полномасштабной покадровой съемке.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Цель 40x/1.3
GCaMP6f, в аденовирусном векторе (тип 5 человека)	Вектор Биолабс	1910 г
Фетальная бычья сыворотка	Сигма-Олдрич	Ф7524-500МЛ
RPMI средний	Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)	61870044
пенициллин/стрептомицин	Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)	15140122
Микроскоп Axiovert 200
Флуо4	Thermo Fisher (Life Technologies)	Ф14201

.