Выделение первичных ацинарных клеток: метод выделения ацинарных клеток из поджелудочной железы мыши

Аннотация

Источник: Fleming Martinez, A. K., et al. Имитация и манипулирование ацинарно-протоковой метаплазией поджелудочной железы в 3-мерной клеточной культуре. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео описывает технику, используемую для выделения ацинарных клеток поджелудочной железы - экзокринных клеток, содержащих различные пищеварительные ферменты. Первичные ацинарные клетки полезны в исследовании ex vivo ацинарно-протоковой метаплазии (ADM) — раннего события в развитии рака поджелудочной железы.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом Jove.

1. Выделение ацинарных клеток

1. Принесите мышь в жертву с помощью индукции CO 2 и выполните вывих шейки матки. Сразу же рассекаем поджелудочную железу. Чтобы рассечь поджелудочную железу, сначала приколите лапы мыши к пенополистирольной крышке, ориентируйте мышь так, чтобы хвост был обращен к исследователю, и опрыскайте брюшную полость 70% этанолом><. заметка: Мышь, использованная в репрезентативных результатах, была 12-недельной нетрансгенной самкой с фоном C57BL/6. Выбор мыши более подробно обсуждается в разделе обсуждения.
   1. Используя набор автоклавных ножниц и щипцов, приподнимите шерсть/кожу щипцами по средней линии и с помощью ножниц сделайте разрез через шерсть и кожу от отверстия уретры до области диафрагмы/грудной клетки.
   2. Сделайте дополнительные разрезы слева и справа так, чтобы шерсть/кожа были срезаны, чтобы создать четкий обзор брюшной полости. Затем разрежьте на брюшную выстилку (посередине, справа и слева) и оттяните ее от органов, как это было сделано с мехом/кожей.
   3. Поднимите кишечник с помощью щипцов и положите его на левую сторону мыши, чтобы было видно поджелудочную железу, которая имеет светло-розовый цвет, и прикрепленную к селезенке, которая имеет темно-красный овал. Ткань поджелудочной железы отличается мягкой, губчатой текстурой. Вырежьте поджелудочную железу, которая будет проходить вдоль желудка и переплетаться с кишечником.
   4. Отделите селезенку от поджелудочной железы. Затем поместите поджелудочную железу в пробирку объемом 50 мл><, содержащую 10 мл HBSS с 1x пенициллин-стрептомицином, и поднесите ее к ламинарному колпаку. заметка: Остальные этапы протокола должны быть выполнены с использованием стерильной техники в ламинарном проточном колпаке.
2. Налейте поджелудочную железу и HBSS (с пенициллин-стрептомицином) в пустую лодку для взвешивания и с помощью щипцов промойте поджелудочную железу, поворачивая ее. Затем переместите поджелудочную железу с помощью щипцов во вторую весовую лодку, содержащую HBSS (с пенициллин-стрептомицином). Снова промойте поджелудочную железу с помощью завихрения.
3. Переместите поджелудочную железу в третью весовую лодку, содержащую HBSS (с пенициллин-стрептомицином), и начните разрезать поджелудочную железу на небольшие кусочки размером 5 мм или меньше. Далее высыпьте кусочки поджелудочной железы и HBSS в пустую трубку объемом 50 мл.
   1. Для этого с помощью щипцов переместите части поджелудочной железы в жидкость во время опрокидывания весовой лодки. Вылейте после того, как все детали больше не будут прикреплены к весовому катеру. Соберите все оставшиеся части с помощью щипцов и промойте щипцы в трубке объемом 50 мл, содержащей поджелудочную железу в HBSS с пенициллин-стрептомицином.
4. Центрифугируйте при давлении 931 x g в течение 2 минут при 4 °C, а затем удалите HBSS (и любой плавающий жир) с помощью пипетки объемом 5 мл.
5. Добавьте 5 мл коллагеназы (Сделайте 40 мл HBSS + 5% FBS, 20 мл HBSS + 30% FBS и 5 мл 2 мг/мл коллагеназы в HBSS. Простерилизовать коллагеназу с помощью фильтрации (поры 0,22 мкм) и хранить при комнатной температуре. Держите каждый из растворов HBSS на льду) до поджелудочной железы. Оберните пробирку объемом 50 мл в пластиковую парафиновую пленку, а затем поместите ее в инкубатор, встряхивая при 220 об/мин, в течение 20 минут при температуре 37 °C.
   заметка: Время расщепления коллагеназы может варьироваться, как отмечалось в обсуждении. По окончании инкубации не должно остаться крупных кусочков ткани.
6. Чтобы остановить диссоциацию, положите трубку, содержащую поджелудочную железу, на лед и добавьте 5 мл холодного HBSS + 5% FBS. Центрифугируйте при 931 x g в течение 2 минут при 4 °C, а затем отпижьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 5 мл.
7. Повторно суспендируйте в 10 мл HBSS + 5% FBS и центрифугируйте при 931 x g в течение 2 мин при 4 °C. Отпипейте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 5 мл и повторите этот шаг с еще 10 мл HBSS + 5% FBS.
8. Ресуспендируйте в 5 мл HBSS + 5% FBS и, используя P1000, перенесите по 1 мл через сетку 500 мкм в пробирку объемом 50 мл. Добавьте еще 5 мл HBSS + 5% FBS через сетку с P1000, чтобы промыть оставшиеся клетки поджелудочной железы через сетку.
9. Поместите клеточную суспензию из ячейки 500 мкм через ячейку 105 мкм, пипетируя по 1 мл с помощью P1000. Далее аккуратно пипетируйте клеточную суспензию в пробирку, содержащую HBSS + 30% FBS. Наверху образуется слой клеточной суспензии; После центрифугирования ацинарные клетки опускаются, образуя гранулы.
10. Центрифугируйте при 233 x g в течение 2 минут при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1x полной среде Waymouth.
    1. Если приступать непосредственно к встраиванию клеток в коллаген или матрикс базальной мембраны, ресуспендировать в объеме 7 мл на поджелудочную железу. Если развилась аденовирусная или лентивирусная инфекция, следует провести ресуспендию по 4 мл на поджелудочную железу.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Встряхивающий инкубатор 37 °C	Термо Сайентиал	SHKE4000-7
5% CO2, 37 °C Инкубатор	НУАЙРЕ	НУ-5500
Тубы 50 мл	сокол	No 352070 (Английский
Впитывающая прокладка, 20" x 24"	Фишербранд	1420662
Игла для прецизионного скольжения BD 21G x 1/2	Научный центр Фишера	305167	Использование в качестве штифтов для вскрытия
Стакан, 600 мл	Фишербранд	ФБ-101-600
центрифуга	Бекман Коултер	Центрифуга Allegra X-15R
Коллагеназа I типа, Clostridium histolyticum	сигма	С0130-1Г	Создайте раствор 100 мг/мл, растворив порошок в стерильной воде молекулярно-биологического класса. При размораживании одной аликвоты разбавить до 10 мг/мл, простерилизовать фильтр и поместить 1 мл аликвоты при температуре -20 °С.
Дексаметазон	сигма	Д1756	Создайте раствор 4 мг/мл, растворив порошок в метаноле, аликвотируя и храня при -20 °C.
Этанол, 200 проба	Лаборатории «Декон»	2701
Фетальная бычья сыворотка	сигма	Ф0926-100мл
щипцы	Инструменты для точной науки	11002-12
щипцы	Инструменты для точной науки	91127-12
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS), без кальция, без магния, без фенола красного	Научный центр Фишера	SH3048801
Ведро для льда, прямоугольное	Научный центр Фишера	Режим 07-210-103
Пакеты для образцов LAB GUARD (для мышей после вскрытия)	Минигрип	SBL2X69S
Парафильм	Бемис	ПМ992	В рукописи упоминается как «пластиковая парафиновая пленка»
ПБС	Научный центр Фишера	SH30028.02
Пенициллин-стрептомицин	ThermoFisher Scientific	15140122
Наконечники для пипеток, 10 μл	США Сайентифик	1110-3700
Наконечники для пипеток, 1000 μл	Olympus Plastics	24-165РЛ
Наконечники для пипеток, 200 μл	США Сайентифик	1111-1700
Пипет-Эйд	Драммонд
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μл	Гилсон	F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μл	Гилсон	F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μл	Гилсон	F123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μл	Гилсон	F123601
Пипетки, 10 мл	сокол	357551
Пипетки, 25 мл	сокол	357525
Пипетки, 5 мл	сокол	357543
Полипропиленовая сетка, 105 μм	Спектрум Лабс	146436
Полипропиленовая сетка, 500 μм	Спектрум Лабс	146418
ножницы	Инструменты для точной науки	14568-12
ножницы	Инструменты для точной науки	14568-13
Бикарбонат натрия (мелкий белый порошок)	Научный центр Фишера	БП328-500
Гидроксид натрия	Научный центр Фишера	С318-500
Ингибитор трипсина сои	Gibco	17075029
шпатель	Фишербранд	Тел.: 21-401-10
Steriflip 50 мл, фильтры 0,22 микрон	Многородность	SCGP00525
Коллаген крысиного хвоста I типа	Корнинг	354236
Waymouth MB 752/1 Средний (порошок)	сигма	Ш1625-10С1Л
Весовой катер, шестигранный, средний	Фишербранд	02-202-101