Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Подготовка материалов, растворов и трехмерных матричных баз
- Разрежьте полипропиленовые сетки 500 μм и 105 μм на квадраты 76 мм на 76 мм. Сложите каждый квадрат пополам дважды, чтобы получился меньший сложенный квадрат. Поместите один квадрат ячеек 500 мкм и один квадрат ячеек 105 мкм в автоклавируемый пакет.
- Автоклавы из полипропиленовой сетки квадраты, а также две пары ножниц и щипцов.
- Приготовьте 100 мл 10-кратного раствора Waymouth. Размешайте 1 флакон (14 г) порошка Waymouth в 50 мл деионизированной (DI) воды и, когда растворится, добавьте 30 мл 7,5% (75 г/л) бикарбоната натрия. Доведите окончательный объем до 100 мл с помощью деионизионной воды и стерилизуйте фильтром.
- Храните 10x Waymouth's media при 4 °C и используйте для приготовления коллагеновых гелей и 1x Waymouth's media. Когда образуются осадки, выбросить.
- Внесите 50 мл 1x полной среды Waymouth на поджелудочную железу, добавив 125 мкл ингибитора соевого трипсина 40 мг/мл, 12,5 мкл 4 мг/мл дексаметазона и 500 мкл фетальной бычьей сыворотки (FBS). Стерилизовать фильтрацией и использовать в течение 48 часов.
- Подготовьте трехмерные матричные основания с использованием коллагена или матрицы базальной мембраны (см. Таблицу материалов для получения информации о продукте). При пипетировании основания положите пластину на лед, избегайте образования пузырей, и поворачивайте пластину сразу после пипетирования на объем каждой лунки, чтобы обеспечить полное покрытие.
- Создавайте коллагеновые основы, смешивая на льду в вытяжке для тканевых культур: 5,5 мл коллагена типа I типа «крысиный хвост», 550 мкл 10x Waymouth's Media и 366,6 мкл 0,34 М NaOH (отфильтрованный).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этого решения достаточно для создания коллагеновых основ для одной 24-луночной, 12-луночной или 6-луночной пластины. Для выделения ацинарной кислоты из одной поджелудочной железы достаточно одной пластины.
- Используйте следующие объемы для пластинирования коллагеновой основы: 80 μL (8-луночный стеклянный слайд), 200 μL (24-луночный планшет), 400 μL (12-луночный планшет) или 800 μL (6-луночный планшет).
- Для оснований матрицы базальной мембраны матрицу пипетируют без каких-либо дополнительных компонентов. Используйте следующие объемы для каждой лунки: 50 μL (8-луночный стеклянный планшет), 120 μL (24-луночный планшет), 240 μL (12-луночный планшет) или 600 μL (6-луночный планшет).
- Дайте основаниям застыть в течение не менее 30 минут в инкубаторе для клеточных культур (37 °C, 5% CO2) перед созданием второго слоя матрицы со встроенными клетками поверх этих оснований.
- При подготовке к ацинарной изоляции держите под капотом один стакан объемом 600 мл, три пробирки по 50 мл, автоклавные ножницы, пару автоклавных щипцов и ведро со льдом под капотом с тремя весовыми лодочками. Затем внесите 30 мл HBSS с 300 мкл 100-кратного пенициллин-стрептомицина, положите по 10 мл в каждую из двух весовых лодок и оставьте последние 10 мл в пробирке объемом 50 мл (для использования в шагах 1.8.2 и 2.1.4).
- Внесите 40 мл HBSS + 5% FBS, 20 мл HBSS + 30% FBS и 5 мл 2 мг/мл коллагеназы в HBSS. Простерилизовать коллагеназу с помощью фильтрации (поры 0,22 мкм) и хранить при комнатной температуре. Держите каждое из решений HBSS на льду.
- Соберите рабочее пространство для рассечения поджелудочной железы, которое можно сделать на лабораторном столе.
- Положите на стол впитывающую прокладку вместе с крышкой из полистирола, покрытой фольгой. Затем сверху на фольгу положите бумажное полотенце с 4 булавками.
- Держите в пределах досягаемости на рабочем месте для вскрытия следующие предметы: мешок для сжигания, один набор автоклавных ножниц и щипцов, пульверизатор с 70% этанолом и ведро со льдом (с 50 мл пробирки HBSS, содержащей пенициллин-стрептомицин из шага 1.6).
- Установите центрифугу на 4 °C и шейкер на 37 °C.
2. Выделение ацинарных клеток
- Пожертвуйте мышью с помощью индукции CO2 и выполните вывих шейки матки. Сразу же рассекаем поджелудочную железу. Чтобы рассечь поджелудочную железу, сначала приколите лапы мыши к крышке из полистирола, ориентируйте мышь так, чтобы хвост был обращен к исследователю, и опрыскайте брюшную полость 70% этанолом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь, использованная в репрезентативных результатах, была 12-недельной нетрансгенной самкой с фоном C57BL/6. Выбор мыши более подробно обсуждается в разделе обсуждения.
- Используя набор автоклавных ножниц и щипцов, приподнимите шерсть/кожу щипцами по средней линии и с помощью ножниц сделайте разрез через шерсть и кожу от отверстия уретры до области диафрагмы/грудной клетки.
- Сделайте дополнительные разрезы слева и справа так, чтобы шерсть/кожа были срезаны, чтобы создать четкий обзор брюшной полости. Затем разрежьте на брюшную выстилку (посередине, справа и слева) и оттяните ее от органов, как это было сделано с мехом/кожей.
- Поднимите кишечник с помощью щипцов и положите его на левую сторону мыши, чтобы было видно поджелудочную железу, которая имеет светло-розовый цвет, и прикрепленную к селезенке, которая имеет темно-красный овал. Ткань поджелудочной железы отличается мягкой, губчатой текстурой. Вырежьте поджелудочную железу, которая будет проходить вдоль желудка и переплетаться с кишечником.
- Отделите селезенку от поджелудочной железы. Затем поместите поджелудочную железу в пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл HBSS с 1x пенициллин-стрептомицином, и поднесите ее к колпаку ламинарного потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные шаги протокола должны быть выполнены с использованием стерильной техники в ламинарном проточном колпаке.
- Налейте поджелудочную железу и HBSS (с пенициллин-стрептомицином) в пустую лодку для взвешивания и с помощью щипцов промойте поджелудочную железу, поворачивая ее. Затем переместите поджелудочную железу с помощью щипцов во вторую весовую лодку, содержащую HBSS (с пенициллин-стрептомицином). Снова промойте поджелудочную железу с помощью завихрения.
- Переместите поджелудочную железу в третью весовую лодку, содержащую HBSS (с пенициллин-стрептомицином), и начните разрезать поджелудочную железу на небольшие кусочки размером 5 мм или меньше. Далее высыпьте кусочки поджелудочной железы и HBSS в пустую трубку объемом 50 мл.
- Для этого с помощью щипцов переместите части поджелудочной железы в жидкость во время опрокидывания весовой лодки. Вылейте после того, как все детали больше не будут прикреплены к весовому катеру. Соберите все оставшиеся части с помощью щипцов и промойте щипцы в трубке объемом 50 мл, содержащей поджелудочную железу в HBSS с пенициллин-стрептомицином.
- Центрифугируйте при давлении 931 x g в течение 2 минут при 4 °C, а затем удалите HBSS (и любой плавающий жир) с помощью пипетки объемом 5 мл.
- Добавьте 5 мл коллагеназы (разведенной в HBSS на шаге 1.7) в поджелудочную железу. Обеспечьте герметичную крышку, обернув пробирку объемом 50 мл в пластиковую парафиновую пленку, а затем поместите ее в инкубатор, встряхивая при 220 об/мин, в течение 20 минут при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время расщепления коллагеназы может варьироваться, как отмечено в обсуждении. По окончании инкубации не должно остаться крупных кусочков ткани.
- Чтобы остановить диссоциацию, положите трубку, содержащую поджелудочную железу, на лед и добавьте 5 мл холодного HBSS + 5% FBS. Центрифугируйте при давлении 931 x g в течение 2 мин при 4 °C, а затем отпижьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 5 мл.
- Повторно суспендируйте в 10 мл HBSS + 5% FBS и центрифугируйте при 931 x g в течение 2 минут при 4 °C. Отпипейте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 5 мл и повторите этот шаг с еще 10 мл HBSS + 5% FBS.
- Ресуспендируйте в 5 мл HBSS + 5% FBS и, используя P1000, перенесите по 1 мл через сетку 500 мкм в пробирку объемом 50 мл. Добавьте еще 5 мл HBSS + 5% FBS через сетку с P1000, чтобы промыть оставшиеся клетки поджелудочной железы через сетку.
- Поместите клеточную суспензию из ячейки 500 мкм через ячейку 105 мкм, пипетируя по 1 мл с помощью P1000. Далее аккуратно пипетируйте клеточную суспензию в пробирку, содержащую HBSS + 30% FBS. Наверху образуется слой клеточной суспензии; После центрифугирования ацинарные клетки опускаются, образуя гранулы.
- Центрифугируйте при 233 x g в течение 2 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1x полной среде Waymouth.
- Если приступать непосредственно к встраиванию клеток в коллаген или матрикс базальной мембраны, ресуспендировать в объеме 7 мл на поджелудочную железу. Если развилась аденовирусная или лентивирусная инфекция, следует провести ресуспендию по 4 мл на поджелудочную железу.
3. Вирусная инфекция
- Поскольку одной поджелудочной железы достаточно для двух вирусных инфекций (контрольной и экспериментальной, например, null и cre), разделите клеточную суспензию между крышками двух 35-мм пластин. Использование крышки пластин позволяет инфекции во взвешенном состоянии и, следовательно, легкому перемещению на конечную подложку позже.
- При работе с вирусом замочите все использованные наконечники пипеток в 10% отбеливателе не менее чем на 15 минут.
Примечание: Использование 35-миллиметровых пластин и объема 4 мл хорошо работает для клеток нетрансгенных мышей в возрасте от 8 до 16 недель. Размер и объем пластины могут потребоваться для животных с меньшей или большей панкреатой.
- Для аденовирусной инфекции добавьте вирус (с титром не менее 107 TU/мл) в соотношении 1:1,000 к крышке каждой пластины и закрутите (Рисунок 1, GFP adenovirus). Поместите планшеты в инкубатор для клеточных культур (37 °C, 5% CO2) и взбалтывайте каждые 15 минут в течение 1 часа. Продолжайте инкубацию еще 2 ч, а затем приступайте к встраиванию клеток в коллаген или матрикс базальной мембраны.
- После завершения вирусной работы в вытяжке замочите все компоненты в капюшоне с 10% отбеливателем не менее чем на 15 минут, а затем тщательно очистите отбеливатель с помощью 70% этанола.
4. Встраивание клеток в коллаген или матрикс базальной мембраны
- Приготовьте коллагеновый гель на льду, смешав 7 мл коллагена крысиного хвоста I типа (3,3 мг/мл), 700 мкл 10-кратной среды Waymouth и 466,6 мкл 0,34 М NaOH.
- Взяв равные объемы коллагенового геля и клеточную суспензию, аккуратно перемешайте. Если вы добавляете стимул или ингибитор, сочетайте это с суспензией коллагеновых клеток. Пластины по одной лунке (пластины из пункта 1.5.3); Держа пластину на льду, поворачивайте, чтобы равномерно распределить коллагеново-клеточный слой.
- В каждую лунку пипетируют следующие объемы суспензии коллагеновых клеток: 200 мкл (8-луночное стекло), 500 μл (24-луночный планшет), 1000 μл (12-луночный планшет) или 2000 μл (6-луночный планшет). Обратите внимание, что ADM индуцируется путем стимуляции TGF-α (50 нг/мл) на рисунке Рисунок 1.
- Для встраивания клеток в матрикс базальной мембраны смешайте однокомпонентный матрикс базальной мембраны с двухкомпонентной клеточной суспензией. Как и в случае с коллагеном, суспензию матриксных клеток, а также пластину держите на льду. Пипетируйте по одной лунке за раз, используя те же объемы, которые указаны в 4.2.1, и перемешивайте для равномерного распределения.
- Поместите планшет в инкубатор для клеточных культур (37 °C, 5% CO2) на 30 минут для застывания, а затем добавьте 1x полную среду Waymouth с любым стимулом или ингибитором (Рисунок 1 использует TGF-α в концентрации 50 нг/мл). Меняйте среду (с помощью стимула или ингибитора) на следующий день, а затем через день. В зависимости от раздражителя ADM может наблюдаться между 3 и 5 днями.
