Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
Необходимые хирургические инструменты показаны на рисунке 1, а принципиальная схема процедуры показана на рисунке 2.
1. Решения
- Приготовьте сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS), добавив 100 мл 10X HBSS (из запаса) в 900 мл дистиллированной воды, чтобы получить 1 л HBSS (1X).
- Приготовьте раствор STOP (должен быть свежим и должен быть использован в течение 1 часа), добавив 50 мл 100X фетальной бычьей сыворотки (FBS) к 450 мл ледяного 1X HBSS; это составит 500 мл раствора STOP. Держите раствор STOP при температуре 4 °C.
- Приготовьте раствор коллагеназы P (должен быть свежим в течение 1 ч после использования), добавив 1 мг/мл коллагеназы P в ледяной 1X HBSS; используйте 6 мл/мышь.
- Добавьте 0,05% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (БСА) в раствор коллагеназы Р (это обеспечивает питательными веществами изолированные островки). Например, используйте 3 мг BSA в 6 мл раствора коллагеназы P. Держите на льду.
- Рассчитайте и приготовьте необходимое количество коллагеназы Р для всех мышей в одной пробирке объемом 50 мл.
- Приготовьте полную среду RPMI 1640 путем добавления 10% FBS, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, клеточной добавки INS-1 (10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола) в 500 мл среды RPMI 1640, содержащей 5,5 мМ глюкозы, для использования для ночного культивирования и инкубации.
2. Подготовка
- Заполните три пробирки по 50 мл ингибирующим РНКазу раствором 25 мл, 70% этанолом или дистиллированным H2O. Эти растворы будут использоваться для очистки хирургических инструментов до и во время процедуры.
- Замочите кончики инструментов в растворе, ингибирующем РНКазу, на 30 минут перед началом протокола; это устраняет любую потенциальную РНКазу на инструментах.
- Предварительно вырежьте абсорбирующие прокладки размером 6 x 6 дюймов для использования во время операции.
- Заранее приготовьте раствор 1X HBSS и храните при температуре 4 °C. Приготовьте раствор STOP перед операцией. Хранить при температуре 4 °C.
- Приготовьте раствор коллагеназы Р непосредственно перед операцией и храните на льду.
заметка: Его следует использовать в течение 2 часов после приготовления.
- Пометьте 50 мл пробирок для сбраживания и очистки; подготовьте по 2 пробирки для каждой мыши, одну для пищеварения, а другую для очищения островков. Убедитесь, что идентификатор животного указан на обеих трубках.
- Добавьте 3 мл раствора коллагеназы Р в первую 50 мл пробирки. Будут введены оставшиеся 3 мл коллагеназы P.
- Наберите оставшиеся 3 мл раствора коллагеназы в шприц объемом 3 мл, в который введено 30 г 1/2 иглы. Поместите шприц на лед.
3. Процедура
- Извлеките все инструменты из ингибирующего раствора РНКазы, затем опустите их сначала в пробирку с 70% этанолом, затем в пробирку, содержащую дистиллированныйН2О, затем просушите на воздухе на чистом бумажном полотенце.
- Поместите мышь в камеру, содержащую 0,5 мл изофлурана, до тех пор, пока мышь не будет глубоко обезболиваться.
- Извлеките мышь из камеры и проверьте состояние анестезии, зажав щипцами подушечку для ног. Глубокая анестезия основана на наблюдении, что дыхание становится неуклонно медленнее, а мышь не реагирует на щипание ноги. Убедившись, что мышь находится под глубоким наркозом, усыпьте мышь с вывихом шейки матки, а затем поместите мышь на впитывающую подушечку.
- Положите мышь под наркозом на ее живот, надавливая на шею и вывихнув позвоночный столб от мозга, потянув за хвост.
- Примотайте конечности мыши в положении лежа на спине к впитывающей прокладке, распылите на тело 70% этанола и сотрите излишки этанола.
- Используйте щипцы для покровного стекла и изогнутые хирургические ножницы для выполнения разрезов. Сначала сделайте горизонтальный разрез на коже области живота (~3 см), широко растяните кожу, чтобы обнажить брюшную стенку. Затем сделайте вертикальный разрез (~3–4 см) на брюшной брюшине, чтобы полностью обнажить поджелудочную железу в брюшной полости (рис. 3).
- Надавите на доли печени вверх, чтобы обнажить желчный проток, он будет выглядеть как бледно-розовая трубка (рисунок 3).
- Осторожно переместите кишечник из правой поясничной/подвздошной области брюшной полости вправо, обнажая желчный проток и печеночную артерию (Рисунок 3).
- Осторожно зажмите общий желчный проток с помощью микросеррефинов Шварца (Рисунок 1) как можно ближе к печени.
- Определите ампулу Фатера, которая расположена в дуоденальном сосочке, образованном слиянием протока поджелудочной железы и общего желчного протока. Ампула Фатера выглядит опухшей при рассмотрении под микроскопом, который является точкой входа в общий желчный проток (рис. 4).
заметка: Регулировка интенсивности/угла света диссекционного микроскопа может облегчить его обнаружение.
- Введите шприц с 3 мл раствора коллагеназы Р в ампулу Фатера. Протолкните иглу в проток примерно на 1/4 длины общего желчного протока (ампула входит в проток), как показано на рисунке 5.
- Как только игла окажется в ампуле, убедитесь, что ориентация иглы такова, что она параллельна протоку.
- Стабилизируйте иглу, зажав ее с помощью микрощипцов Адсона, чтобы предотвратить прокол протока (Рисунок 5).
- Медленно и неуклонно введите 3 мл раствора коллагеназы Р из шприца в общий желчный проток (достаточно, чтобы почувствовать сопротивление), как показано на рисунке 6. Цель состоит в том, чтобы создать давление обратного потока, чтобы заставить коллагеназу проникнуть в проток поджелудочной железы. Инъекция считается успешной, если головка, шея, тело и хвостовая область поджелудочной железы полностью надут><ы.
заметка: Урожайность островков будет низкой, если либо поджелудочная железа не полностью надута, либо область селезенки не полностью надута. В области селезенки находится наибольшее количество островков6. Раздувание может быть подтверждено появлением открытых пространств между тканью поджелудочной железы, которые заполнены раствором.
- Осторожно рассеките надутую поджелудочную железу и поместите ее в пробирку для пищеварения объемом 50 мл, содержащую 3 мл ледяного раствора коллагеназы P.
- Удалите поджелудочную железу с помощью 2 щипцов (изогнутый и Micro Adson; Смотрите рисунок 1): (начиная с селезенки, оттяните поджелудочную железу от селезенки и продолжайте удаление из желудка и вдоль двенадцатиперстной кишки.
заметка: Разрезы не требуются.
- Измельчите поджелудочную железу в течение 3–5 с в пищеварительной трубке с 3 мл ледяного раствора коллагеназы P с помощью тонких хирургических ножниц (рис. 7А).
- Закрепите трубку на решетке на водяной бане при температуре 37 °C и встряхивайте при 100–120 об/мин в течение примерно 12–13 минут.
- После инкубации осторожно встряхните пробирки вручную, чтобы разрушить ткань до тех пор, пока раствор для расщепления коллагеназы Р не станет однородным (рисунок 7B). Однородность подтверждается пескообразным внешним видом мелких частиц поджелудочной железы. Обычно достаточно около 30 секунд нежного рукопожатия. Поднесите трубку к свету, чтобы проверить, хорошо ли гомогенизирована ткань; При необходимости встряхните еще ~15 с.
- После переваривания немедленно поместите пробирки на лед и добавьте 40 мл ледяного раствора STOP><, чтобы остановить ферментативное разложение.
заметка: На этом этапе пищеварительные трубки можно оставлять на льду до 2 часов, если работать на нескольких мышах.
- Центрифугируйте пробирку в центрифуге с качающимся ведром при давлении 300 x g в течение 30 с (температура центрифуги является гибкой).
заметка: Используйте центрифугу с качающимся ведром таким образом, чтобы тканевая гранула образовывалась на дне пробирки объемом 50 мл, а не на стенке пробирки; Это имеет решающее значение для повышения урожайности островков.
- Сцедите и повторите центрифугирование раствором STOP еще 2 раза, сцеживая раствор после каждого отжима. Используйте 20 мл раствора STOP для каждого последующего мытья.
- Перед каждым отжимом разбивайте гранулу, осторожно встряхивая тканевую гранулу в пробирке объемом 50 мл в растворе STOP объемом 20 мл.
- Повторно суспензируйте тканевую гранулу с 40 мл ледяного HBSS и центрифугируйте при 300 x g в течение 30 с.
- Сцедите и повторите центрифугирование с помощью центрифуги с качающимся ведром с раствором HBSS еще два раза, сцеживая раствор после каждого вращения. Используйте 20 мл HBSS для каждой стирки.
- Перед каждым отжимом разбивайте гранулу, чтобы отсоединить ее от дна трубки, осторожно встряхивая трубку, содержащую 20 мл раствора HBSS.
- После последнего центрифугирования удалите все HBSS.
- Затем добавьте 5 мл градиента плотности комнатной температуры в 50 мл пробирки, содержащей гранулу. Кратковременно переведите вихрь на низкой скорости до гомогенизации.
- Добавьте еще 5 мл градиента плотности комнатной температуры в пробирку объемом 50 мл. Не перемешивайте.
заметка: Очень важно оставаться устойчивым и неподвижным, чтобы обеспечить формирование лучшего градиента без нарушений.
- Внесите 10 мл буфера HBSS комнатной температуры в пробирку (содержащую градиент плотности), капля за каплей осторожно и медленно, чтобы образовался градиент. Используйте пистолет-дозатор с пипеткой объемом 10 мл, чтобы добавить HBSS по каплям.
- Используя центрифугу с качающимся ведром, вращайте пробирки при давлении 1700 x g в течение 15 мин. Обязательно измените скорость ускорения/замедления на самую низкую настройку, чтобы сохранить градиент (Рисунок 7C).
- После отжима аккуратно извлеките трубки, не нарушая градиент. С помощью пистолета-дозатора, предварительно смоченного холодным HBSS (пипетка HBSS вверх и вниз), пипетка выводит слой островков (5–10 мл), образовавшийся между градиентом плотности и HBSS, в новую пробирку для сбора островков объемом 50 мл.
заметка: Перед пипетированием островков полезно смочить пипетку холодным HBSS, чтобы предотвратить прилипание островков к внутренним стенкам пипетки.
- В случае, если разделение не завершено, островки будут видны в слое градиента плотности, пипетка выведет все 10 мл градиента плотности (нижний слой) вместе с островковым слоем, образованным на границе раздела (только для того, чтобы оставить около 8–10 мл верхнего слоя HBSS><).
заметка: Сбор как островкового слоя, так и слоя градиента плотности (нижнего слоя) может привести к сбору мусора, что может увеличить время сбора островков, но никакие другие шаги не будут изменены. Собирать оба этих слоя не нужно, когда островковый слой хорошо сформирован.
- Добавьте 20 мл ледяного HBSS в новую 50 мл пробирки, содержащую островки, затем центрифугируйте при 350 x g в течение 3 минут в центрифуге с качающимся ведром.
- После отжима осторожно измельчите пипеткой (не сцеживайте) надосадочную жидкость (оставьте ~3 мл на дне), не потревожив гранулу, содержащую островки на дне. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Повторите промывку и центрифугирование не менее 3 раз. Добавляйте 20 мл HBSS каждый раз, и обязательно подвешивайте гранулу перед каждым вращением.
- Перед использованием нагрейте флакон RPMI-1640 в сборе на водяной бане при температуре 37 °C. После последнего центрифугирования удалите весь HBSS и добавьте в гранулу 4 мл предварительно приготовленной полной среды RPMI-1640 (содержащей FBS, клеточную добавку INS-1 и пенициллин/стрептомицин).
- Выбейте гранулу, осторожно вращая трубку, и сразу же налейте фильтрующий материал RPMI-1640 в чашку Петри диаметром 100 мм. Добавьте в пробирку еще 5 мл фильтрующего материала RPMI-1640 и аккуратно взболтайте его, чтобы смыть остатки островков, затем также вылейте фильтрующий материал в ту же чашку Петри.
- Под диссекционным микроскопом выберите здоровые островки из чашки Петри с помощью пипетки объемом 20 мкл и поместите их в новую чашку Петри, содержащую 10 мл полной среды RPMI 1640. При рассмотрении под микроскопом вскрытия островки должны казаться сферическими/продолговатыми и золотисто-коричневого цвета с гладкой поверхностью по сравнению с относительно прозрачной, тонкой экзокринной тканью.
заметка: Увеличение диссекционного микроскопа обычно устанавливается в 12,5–16 раз. Урожайность островков будет варьироваться в зависимости от различных факторов, включая сорт, возраст и пол мыши. Этот протокол обычно дает 250–350 здоровых островков от здоровых мышей C57BL/6J в возрасте 4–10 месяцев.
- Инкубируйте островки в стерильном инкубаторе при температуре 37 °C с инфузией 5%CO2 и 95% увлажненным воздухом в течение ночи для экспериментов на следующий день или заморозьте островки для желаемого анализа в более позднее время.
- После замораживания островки их нельзя использовать для анализа секреции, только для количественного определения РНК или белка. Чтобы собрать клетки для замораживания, поместите их в буфер HBSS, соберите все островки в 200–500 мкл буфера, переложите в пробирку объемом 1,5 мл, центрифугируйте 350 х г в течение 1–2 мин, удалите надосадочную жидкость, оставив не более 30–40 мкл раствора, поместите в -20 °С для кратковременного хранения (несколько дней) или -80 °С для длительного хранения.
