Иммунофлуоресцентное окрашивание сфероидов: методика анализа сфероидов на экспрессию внутри- и внеклеточных антигенов

Аннотация

Источник: Cavaco, A. C. M. et al. 3D модель сфероида как более физиологичная система для дифференцировки и инвазии фибробластов, ассоциированных с раком, в исследованиях in vitro. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео описывает технику иммунофлуоресцентного окрашивания сфероидов для понимания дифференцировки фибробластов или CAF. Этот протокол помогает обнаруживать экспрессию внутри- и внеклеточных антигенов, включая отложение белков ECM внутри сфероидов.

Протокол

1. Иммунофлуоресцентное окрашивание сфероидов

1. Соберите сфероиды примерно через 24 ч в одну реакционную пробирку объемом 1,5 мл для каждого экспериментального условия или для каждого анализируемого белка. Например, сфероиды iNF, стимулированных TGF-β1, помещают в пробирку, отличную от контрольных iNF, которые не подвергались лечению. Чтобы избежать разрыва сфероидов из-за слишком сильных сдвиговых сил, отрежьте конец наконечника пипетки, чтобы увеличить отверстие. Включите не менее 5-10 сфероидов в одну реакционную пробирку, чтобы обеспечить возможность репликации и учесть возможные потери на этапах промывки.
2. Центрифугируйте сфероиды с помощью настольной центрифуги в течение примерно 30-60 с при давлении 1000 x g. Осторожно удалите метилцеллюлозосодержащий надосадочный слой методом пипетирования, не нарушая гранулированные сфероиды.
3. Вымойте 50 мкл 1x PBS. Повторите этап центрифугирования и осторожно удалите PBS с помощью пипетирования, как описано в 1.2.
4. В зависимости от окрашиваемого белка зафиксировать 50 мкл 4% параформальдегида в PBS в течение 20 минут при комнатной температуре (для αSMA, NG2 и интегрина α3β1) или с 50 μл метанола в течение 10 минут при -20 °C (для субъединиц ламинина-332).
5. Повторите этап стирки, как описано в шагах 1.2-1.3.
6. Пермеабилизируйте клетки 0,1% Triton-X в PBS в течение 4 мин при комнатной температуре.
7. Повторите этап стирки, как описано в шагах 1.2-1.3, три раза.
8. Инкубируйте сфероиды в PBS, содержащем 5% FBS и 2% BSA, в течение 1 ч в режиме ЛТ, чтобы блокировать неспецифические сайты взаимодействия с белками.
9. Инкубируйте сфероиды с 30 мкл первичных антител в PBS, 2,5% FBS и 1% BSA при 4 °C в течение ночи. Использовали следующие первичные антитела: анти-αSMA Cy-3 конъюгированный и анти-NG2 в дозе 5 мкг/мл; BM2 антиламинин α3, 6F12 антиламинин β3 и антиламинин γ2 20 мкг/мл.
10. Повторите этап стирки, как описано в шагах 1.2-1.3, три раза.
11. Инкубировать сфероиды с 30 мкл вторичных антител в PBS, 2,5% FBS и 1% BSA в режиме ЛТ в течение 90 мин. В качестве вторичных антител использовались: Alexa 488 против кролика и против мышей (5 мкг/мл).
12. Повторите этап стирки, как описано в шагах 1.2-1.3, три раза.
13. Инкубируйте клетки с 30 μл окрашивающего раствора DAPI в течение 4 минут при комнатной температуре.
14. Повторите этап стирки, как описано в шагах 1.2-1.3.
15. Поместите сфероиды на предметное стекло, в каплю PBS, с помощью стеклянной пастеровской пипетки.
16. Визуализируйте сфероиды с помощью флуоресцентной микроскопии в лазерном сканирующем микроскопе с увеличением 10x. Возьмем различное оптическое сечение сфероида в разных оптических плоскостях z-стека (15-20 плоскостей стека). Для установки настроек лазера в микроскопе используют сфероид, состоящий из клеток, отрицательных по интересующему антигену, или сфероид, окрашенный только вторичным антителом. Повторно используйте одни и те же настройки для всех образцов, которые будут сравниваться.
17. Анализируйте микроскопические изображения с помощью программного обеспечения ImageJ, опубликованного ранее. Эти шаги кратко представлены на рисунке 1. В качестве фона определите интегральную плотность сигнала бессотовой области интереса (ROI). Рассчитайте общую скорректированную флуоресценцию клеток (TCCF) как:
    TCCF = интегральная плотность сигнала - (площадь выбранного сфероида x средняя флуоресценция фона)
18. Определите общую скорректированную флуоресценцию (TCF) сфероидов по мере нормализации TCCF до площади сфероида и количество стеков.
    TCF = TCCF сфероида / (площадь сфероидов x количество стопок)

Результаты

Рисунок 1. Последовательные этапы количественной оценки иммунофлуоресцентного окрашивания представляющего интерес белка у сфероидов с использованием ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
4',6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид (DAPI)	СИГМА-ОЛДРИЧ	Д9542-10
6F12 анти-ламинин β3 субъединица мыши (моноклональная)			самодельный
Фракция альбумина V - BSA	АпплиХим	А1391
Alexa fluor 488 Goat (поликлональный) анти-мышь	Инвитроген	А11029
Alexa fluor 488 Козий (поликлональный) кролик	Инвитроген	А11034
Антиламинин γ2 субъединица мыши (моноклональный)	Санта-Крус	СК-28330
Настольная центрифуга	Научный центр Фишера	Тел.: 50-589-620	росток
BM2 антиламининовая α3 субъединица мыши (моноклональная)			Любезно предоставлено профессором Патрицией Руссель, CNRS, Лион
Центрифужные пробирки 50 мл	Корнинг	430290
Конфокальный микроскоп	Цейсс
DMEM (высокий уровень глюкозы 4,5 г/л)	Лонза	БЭ12-604Ф
Первичные фибробласты поджелудочной железы человека	ПЕЛОБиотех	ПБ-Н-6201
Пенициллин/стрептомицин	Gibco	15140-122
Предметные стекла для микроскопа	Термо Сайентиал	J1800AMNZ
Параформальдегид	Ридель-де Хаэн	16005
ТритонХ-100	СИГМА-ОЛДРИЧ	Х100РС