Иммунофлуоресцентное окрашивание сфероидов: методика анализа сфероидов на экспрессию внутри- и внеклеточных антигенов

Аннотация

Источник: Cavaco, A. C. M. et al. 3D модель сфероида как более физиологичная система для дифференцировки и инвазии фибробластов, ассоциированных с раком, в исследованиях in vitro. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео описывает технику иммунофлуоресцентного окрашивания сфероидов для понимания дифференцировки фибробластов или CAF. Этот протокол помогает обнаруживать экспрессию внутри- и внеклеточных антигенов, включая отложение белков ECM внутри сфероидов.

Протокол

1. Иммунофлуоресцентное окрашивание сфероидов

1. Соберите сфероиды примерно через 24 ч в одну реакционную пробирку объемом 1,5 мл для каждого экспериментального условия или для каждого анализируемого белка. Например, сфероиды iNF, стимулированных TGF-β1, помещают в пробирку, отличную от контрольных iNF, которые не подвергались лечению. Чтобы избежать разрыва сфероидов из-за слишком сильных сдвиговых сил, отрежьте конец наконечника пипетки, чтобы увеличить отверстие. Включите не менее 5-10 сфероидов в одну реакционную пробирку, чтобы обеспечить возможность репликации и учесть возможные потери на этапах промывки.
2. Центрифугируйте сфероиды с помощью на....

Результаты

Рисунок 1. Последовательные этапы количественной оценки иммунофлуоресцентного окрашивания представляющего интерес белка у сфероидов с использованием ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
4',6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид (DAPI)	СИГМА-ОЛДРИЧ	Д9542-10
6F12 анти-ламинин β3 субъединица мыши (моноклональная)			самодельный
Фракция альбумина V - BSA	АпплиХим	А1391
Alexa fluor 488 Goat (поликлональный) анти-мышь	Инвитроген	А11029
Alexa fluor 488 Козий (поликлональный) кролик	Инвитроген	А11034
Антиламинин γ2 субъединица мыши (моноклональный)	Санта-Крус	СК-28330
Настольная центрифуга	Научный центр Фишера	Тел.: 50-589-620	росток
BM2 антиламининовая α3 субъединица мыши (моноклональная)			Любезно предоставлено профессором Патрицией Руссель, CNRS, Лион
Центрифужные пробирки 50 мл	Корнинг	430290
Конфокальный микроскоп	Цейсс
DMEM (высокий уровень глюкозы 4,5 г/л)	Лонза	БЭ12-604Ф
Первичные фибробласты поджелудочной железы человека	ПЕЛОБиотех	ПБ-Н-6201
Пенициллин/стрептомицин	Gibco	15140-122
Предметные стекла для микроскопа	Термо Сайентиал	J1800AMNZ
Параформальдегид	Ридель-де Хаэн	16005
ТритонХ-100	СИГМА-ОЛДРИЧ	Х100РС