Все процедуры, связанные с животными моделями, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом Jove.
1. IRE опухолей SQ
- Подготовьте необходимые материалы: электропоратор с прямоугольной палочкой, предохранительный ножной выключатель, электроды (игольчатая решетка против пинцайзера) и адаптеры. Держите под рукой стерильные швы (нерассасывающиеся 4-0), спиртовые тампоны, машинки для стрижки волос, крем для депиляции, смазку для глаз, ватную марлю, бупренорфин и анестетики.
- Простерилизуйте пинцет или игольчатые электроды с помощью газовой стерилизации. Автоклавирование не рекомендуется. Используйте стерилизатор со стеклянными шариками для стерилизации электродов между животными.
- Следуйте инструкциям, чтобы успешно вызвать анестезию у мышей, как только опухолевый имплантат SQ достигнет 5 мм в диаметре. Кратко введите мыши-реципиенту 0,05 - 1 мг/кг анальгетика бупренорфина SQ за 30 минут до операции. Затем обезболите мышей-реципиентов 2-3% изофлураном в кислороде (2 л/мин) с помощью прецизионного испарителя (или других анестетиков). Держите мышей на грелке при температуре 37 °C в течение всей процедуры. Нанесите лубрикант на глаза, чтобы предотвратить высыхание. Проверьте глубину анестезии по отсутствию пугающего рефлекса на начальном этапе и подтвердите операционную анестезию по отсутствию педального рефлекса с легким пощипыванием пальцев ног. Сохраняйте анестезию в течение всей хирургической процедуры.
- Положите мышь под наркозом на бок, чтобы получить доступ к опухоли SQ на боку. Удалите волосы с помощью машинки для стрижки и очистите кожу с помощью спиртового тампона.
- Для опухолей SQ используйте электроды с 2-игольчатой решеткой. Приподнимите кожу непосредственно под опухолевым участком с помощью щипцов и введите электроды через кожу параллельно телу, следя за тем, чтобы они не проникли в брюшную полость. Пройдя через кожу, расположите электроды таким образом, чтобы они обхватывали опухоль.
- Запрограммируйте электропоратор на выдачу импульсов длительностью 100 мкс с частотой 1 Гц при напряжении 1 500 В/см, всего 150 импульсов. Подавайте импульсы с помощью ножной педали. Разделите каждый набор из 10 импульсов на 10 с, чтобы обеспечить рассеивание тепла и подтвердить правильное положение электродов.
заметка: Без использования паралитических агентов мыши будут испытывать мышечные сокращения при IRE, которые могут вызвать смещение электродов, если их не закрепить вручную.
- Снимите электроды после полного дозирования, которое не должно превышать 200 с. Запишите фактическое подаваемое напряжение, которое отображается на электропораторе. Дайте мышам восстановиться после IRE в их домашней клетке со свободным доступом к пище и воде. Поместите клетку на грелку, чтобы облегчить восстановление. Контролируйте жизненно важные показатели, такие как дыхание, перфузия и т. д., во время процесса восстановления. Подтвердите признаки коррекции рефлекса, как только мышь выздоровеет, а затем верните клетку банки в обычное жилье. Вводите бупренорфин в дозе 0,05 - 0,1 мг/кг через 8 - 12 ч после операции и каждые 8 - 12 ч после процедуры по мере необходимости при появлении признаков боли.
2. IRE ортотопических опухолей
ПРИМЕЧАНИЕ: IRE ортотопических опухолей включает в себя вторую операцию по выживанию на той же мыши, поэтому требуется специальное одобрение местного IACUC перед началом.
- Подготовьте необходимые материалы: автоклавируйте хирургические инструменты, такие как ножницы, скальпели, игольные наконечники, остроконечные щипцы и щипцы с плоским наконечником. Также держите под рукой: стерильные шовные материалы (рассасывающиеся 6-0 и нерассасывающиеся 4-0), спиртовые тампоны, машинки для стрижки волос, крем для депиляции, лубрикант для глаз, ватную марлю, 10% раствор повидон-йода, хирургические простыни, грелки, квадратный электропоратор, защитный ножной выключатель, электроды и их адаптеры, бупренорфин и анестетики.
- Оцените рост ортотопических опухолей у мышей с помощью биолюминесцентной визуализации in vivo. Следите за ростом опухоли с помощью визуализации, начиная с 4-го дня после ортотопической имплантации, и выполняйте визуализацию два раза в неделю. В день визуализации введите (внутрибрюшинное введение) 30 мг/кг D-люциферина мыши-реципиенту под наркозом (2-3% изофлурана в кислороде (2 л/мин)) за 10 минут до визуализации. Изображение на активность люциферазы с использованием люминесцентной настройки без каких-либо эмиссионных фильтров для выдержки не менее 5 с в люминесцентном тепловизоре с бесфлуоресцентным нагреваемым столиком и при сохранении анестезии для мышей.
заметка: Ортотопические опухоли идеально подходят для лечения IRE через 8-10 дней после имплантации, когда опухоли хорошо видны и все еще ограничены поджелудочной железой, как это видно на люминесцентных изображениях люциферазы
- Следуйте инструкциям, чтобы найти имплантированную опухоль. Кратко введите мыши-реципиенту 0,05 - 1 мг/кг анальгетика бупренорфина SQ за 30 минут до операции. Обезболите мышей-реципиентов 2 - 3% изофлураном в кислороде (2 л/мин) с помощью прецизионного испарителя (или других анестетиков). Держите мышей на грелке при температуре 37 °C в течение всей процедуры. Нанесите лубрикант на глаза, чтобы предотвратить высыхание. Проверьте глубину анестезии по отсутствию пугающего рефлекса на начальном этапе и подтвердите операционную анестезию по отсутствию педального рефлекса с легким пощипыванием пальцев ног. Сохраняйте анестезию в течение всей хирургической процедуры. Положите мышь на спину и аккуратно поверните ее на правый бок так, чтобы левая сторона живота была обнажена. Удалите волосы на животе мыши с помощью крема для депиляции и очистите марлей, чтобы свободные волосы не попали в брюшную полость после разреза. Подготовьте левую брюшную полость к операции с помощью 3 циклов 10% повидон-йода с последующим нанесением спиртовых салфеток для дезинфекции кожи. С помощью стерильного скальпеля сделайте поперечный или косой разрез на коже на 1,5 см, на 1 см левее средней линии, ниже грудной клетки, немного медиально к селезенке. Затем продлите разрез через брюшную мускулатуру, отражая вышележащий поверхностный разрез. Найдите селезенку с помощью щипцов с плоским наконечником и аккуратно выведите ее наружу из брюшной полости. Втяните селезенку с помощью стерильного ватного аппликатора и найдите хвост поджелудочной железы, прикрепленный к нижней части селезенки. С помощью щипцов с плоским концом втяните хвост поджелудочной железы в сторону. Если опухоль нелегко обнаружить, используйте щипцы с тупым носом, чтобы переместить живот и осторожно опорожнить селезенку, чтобы определить опухоль.
- Выведите опухоль наружу с помощью щипцов с тупым носом и плотно захватите опухоль платиновыми электродами пинцета. Подайте импульсы электропорации, как запрограммировано на шаге 1.7, с помощью электропоратора прямоугольной формы в наборах по 10 импульсов, управляемых ножным переключателем.
- Держите опухоль экстернализированной в течение как минимум 60 с после IRE для мониторинга любых признаков кровотечения. Вставьте опухоль обратно в брюшную полость и закройте разрез, как описано. Вкратце, закройте мышцы живота с помощью рассасывающегося шва 6-0 с непрерывным или прерывистым швом, а вышележащую кожу закройте нерассасывающимся прерывистым швом от 3-0 до 6-0. На этом этапе прекратите введение анестезии. Дайте мыши восстановиться, как описано в разделе 1.7. Следите за мышью до тех пор, пока она не восстановится.
- Мониторинг влияния ИРЭ на рост опухоли с помощью визуализации люциферазы in vivo в соответствии с шагом 2.2.
