Магнитно-биопечатные 3D-сфероидные кокультуры: метод совместного культивирования раковых клеток и фибробластов

Аннотация

Источник: Ноэль. и др.Получение и метаболический анализ трехмерных сфероидных кокультур раковых клеток поджелудочной железы и фибробластов. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео объясняет 3D-магнитную биопечать совместно культивируемых раковых клеток и фибробластов поджелудочной железы. Клетки рака поджелудочной железы и активированные клетки фибробластов поджелудочной железы совместно культивируются и намагничиваются с использованием биосовместимой сборки наночастиц для получения сфероидов под воздействием магнитных сил.

Протокол

1.Культивирование 3D-сфероидов рака поджелудочной железы с использованием магнитной биопечати

1. Используя стандартный метод асептического культивирования тканей, культивирование интересующих клеток в колбе T75 до конфлюенции 70-80% в соответствующих питательных средах.
   заметка: Как правило, собирали 5-7 × 10⁶ клеток из 70-80% сливающейся колбы Т75. В этом исследовании использовались два различных типа клеток - Patu8902 (опухолевые клетки поджелудочной железы) и PS1 клетки (активированные звездчатые клетки поджелудочной железы). Обе клеточные линии культивировали в среде 1640 (RPMI-1640) Мемориального института Розуэлл Парк с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1× пенициллин-стрептомицина (p/s).
2. Промойте ячейки один раз 5 мл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS).
3. Отделите клетки от пластиковой поверхности путем трипсинизации 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в течение 5-10 мин при 37 °C. Проверьте наличие отслоения клеток под микроскопом.
4. Деактивируйте трипсин путем добавления 8 мл питательной среды к отделенным клеткам. Избегайте чрезмерной трипсинизации, так как это может негативно сказаться на здоровье/жизнеспособности клеток.
5. Пипетируйте клетки вверх и вниз для получения суспензии одной клетки и подсчитывайте плотность клеток с помощью автоматического счетчика клеток или гемоцитометра.
6. Тем временем уравновесьте флакон с NS до температуры окружающей среды.
7. Рассчитайте количество клеток, необходимых для засеивания желаемого количества сфероидов (лунок) и аликвоты на новую коническую трубку объемом 15 мл. Например, чтобы засеять весь планшет на 96 лунок 5000 клеток/лунку, аликвотьте по меньшей мере 5,5 × 10⁵ клеток.
8. Соберите клетки центрифугированием при 500 x g в течение 3 мин. Тщательно сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в концентрации^1,0 x 10 6 клеток/мл в питательной среде. Аккуратно пидавайте пипетку с широким просверленным кончиком пипетки, чтобы избежать сдвига. Например, ресуспендировать 5,5 х 10⁵ клеток в 550 мкл питательной среды.
9. Намагничьте нужное количество ячеек с помощью уравновешенного NS (шаг 1.6).
   1. Непосредственно добавляйте NS в клеточную суспензию в питательной среде и осторожно перемешивайте. Для эффективной магнитной маркировки клеток используйте 10 μL NS на 100 μL клеток (ресуспендированные при 1 x 10⁶ клеток/мл).
      заметка: Для типичного эксперимента пометьте 5,5×10 5 элементов Patu8902 в 550 мкл 55 мкл NS и 1,1×10⁶ элементов PS1 в 1100 мкл (отдельно) 110 мкл NS.
   2. Аккуратно переверните трубку несколько раз, чтобы обеспечить суспензию клеток. Временно перенесите смесь cell-NS в одну лунку 24-луночного планшета. Делайте это отдельно для каждого типа намагничиваемых ячеек. Накройте пластину и инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 2 ч с легким встряхиванием, чтобы дать возможность NS закрепиться на поверхности клетки.
      заметка: С помощью этого метода в независимых экспериментах было успешно получено культивирование и анализ сфероидов, начиная либо только с клеток Patu8902, либо из клеток PS1, в дополнение к совместному культивированию сфероидов, начиная с обоих типов клеток, предварительно смешанных перед печатью на магнитных носителях. Способ получения сфероидов совместной культуры из клеток Patu8902 и PS2 описан ниже на последующих этапах.
10. Аккуратно намагничивайте намагниченные ячейки с помощью пипетки вверх и вниз, чтобы равномерно перемешать и приготовить мастер-смесь, содержащую желаемое количество клеток. Для посева сфероидов используйте в общей сложности 15 000 клеток (5 000 Patu8902 + 10 000 PS1) и доведите до общего объема 150 мкл на лунку 96-луночного планшета><. заметка: Конечный объем, выдаваемый в каждую лунку, должен быть одинаковым независимо от количества используемых ячеек.
11. Поместите 96-луночный репеллентный клеточный планшет на 96-луночный магнитный сфероид и нанесите 150 μл клеточной смеси в каждую лунку. Наблюдайте, как клетки медленно собираются к центру лунки над магнитом. Накройте крышкой и инкубируйте планшет в течение ночи в инкубаторе с 5% содержанием_CO2, установленном при температуре 37 °C, с прикрепленным магнитным сфероидным приводом. Снимите магнитный привод и инкубируйте для дальнейшего роста до 7 дней.
    заметка: Для печати сфероидов с помощью магнитных сфероидных приводов крайне важно использовать пластины для роста, отталкивающие клетки. Убедитесь, что используется сфероидный привод с более тонкими магнитами меньшего размера, а не удерживающий привод.
12. Следите за ростом сфероидов каждый день. Пополняйте запасы свежей питательной среды каждые три дня, расположив пластину роста, установленную на магнитном удерживающем приводе, под углом и используя многоканальную пипетку для вытягивания отработанной среды.
    заметка: Клетки Patu8902 и PS1, посеянные в соотношении 15 000 клеток/лунку, вырастут в трехмерные сфероиды диаметром 400-600 мкм в течение 5-7 дней. На этом этапе сфероиды готовы к метаболической характеристике, оценке лекарств и другим последующим применениям.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,05% Трипсин ЭДТА	сигма	No 25300-054
96-луночная пластина для отпугивания ячеек	США Scientific/ Griener Bio-One	No 655970 (Английский	сфероидная пластина роста
Целлометрия Слайды для подсчета клеток	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Магнитный сфероидный привод n3D	Нано3D бионаука	655841	Входит в состав набора Spheroid Bioprinting Kit
Магнитный сфероид n3D holding гнать	Нано3D бионаука	655841	Входит в состав набора Spheroid Bioprinting Kit
n3D NanoShuttle-PL	Нано3D бионаука	655841	Входит в состав набора для биопечати сфероидов: хранить при температуре 4 °C
Ячейки Patu8902	Лабораторный фонд		Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы Клетки
Элементы PS1	Лабораторный фонд		активированные звездчатые клетки поджелудочной железы
RPMI1640	Gibco	11875-093	питательные среды для клеток, сфероиды